科研 | 厦门大学Nature子刊：底物调节导致微生物氨氧化群落对海洋暖化的不同反应
编译：王一，编辑：小菌菌、江舜尧。
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背景：在频繁的人为活动导致大量氮输入的背景下，了解氨氧化过程（AO）如何响应海洋暖化，对于预测未来海洋中氮相关的生物地球化学变化至关重要。此外，AO与海洋碳循环也有多种互作，并涉及多种气候反馈进程。温度是调节生物代谢率的主要驱动力。但对于AO如何响应海洋暖化方面探索不足，特别是对于氨氧化速率（AOR）较高的区域，例如河口，沿海地区和外海富营养区底部。这些区域环境也是人为氮干扰和海洋暖化的前沿地区。氨氧化成员如何响应广阔海洋中的热胁迫，以及对人为氮输入进入海洋的协同作用均未知。
方法优势与创新：为了更好地预测海洋氮相关生物地球化学的未来趋势，采用操控实验表征海洋AO微生物群落在环境梯度底物变化过程中的温度响应。使用同位素标记技术和一系列温度/底物操控孵育实验，研究人员揭示了从沿海富营养化水域到近海富营养化区域（沿底物浓度梯度变化的），海洋AO群落对不同温度的响应模式。
结果：结果展示了海洋AO在整个向岸/离岸营养梯度上的不同热响应模式。发现氨氧化群落和环境底物共同调节着最优温度（Topt），在Topt≤14℃和≥34℃时会产生独特的热响应模式。当环境底物不饱和时，底物的添加会提高Topt。动力学参数的热敏感性可以在底物变化和温度变化（低于临界温度）时预测AO速率和Topt的响应。海洋暖化促进了近岸水域的AO，却抑制了离岸水域AO。该结果中和了AO温度效应的矛盾，表明在这一关键的氮循环过程中建立预测性的生物地球化学模型需要考虑到这种不同的升温机制。
论文ID
原名：Substrate regulation leads to differential responses of microbial ammonia-oxidizing communities to ocean warming
译名：底物调节导致微生物氨氧化群落对海洋变暖的不同反应
期刊：Nature Communications
IF：11.8
发表时间：2020.6
通讯作者：高树基
作者单位：厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室
主要内容
采样点范围为从河口（九龙河）到海盆（中国南海），在氨氧化过程最活跃的水层收集水样。从每个采样点采集100mL样品过滤后冰冻保存，进行营养物分析（盐度、温度、铵浓度、亚硝酸盐和硝酸盐浓度），随后采集水样用于以下实验：
1.温度操控实验：为量化温度对AO的影响，按~5℃的间隔在14-34℃之间设置了4-5个温度梯度进行实验。
2.氨氧化速率孵育实验：添加15N标记的15NH4Cl到水样中，测定氨氧化速率。为了检测孵育期内15NOx-生成的线性关系，对来自河口和海盆采样点的样本进行了时间系列孵育实验。把最终添加的示踪剂浓度小于原位铵浓度的2倍，定义为环境底物水平（AORambient）的氨氧化速率。较高的示踪剂添加量被定义为富足底物水平（AORenriched）的氨氧化速率。
3.Michaelis–Menten动力学实验：进行了实验以确定氨氧化随温度变化的Michaelis-Menten动力学。
4.抑制实验：为了区分古菌氨氧化作用和细菌氨氧化作用的相对贡献大小，对各采样点样品添加15NH4+和80 μM的烯丙基硫脲（ATU）（可以抑制AOB的β蛋白酶，对AOA影响很小），通过与未添加ATU的对照组比较得出的差异为AOB的速率。
最后对上述实验中氨氧化速率进行测定，并建立DAMM模型和Topt模型。
结果与讨论
1 随底物梯度浓度变化的不同温度响应
在~14到~34℃的温度范围内，环境铵水平为14nM到96μM的孵育实验中，在环境底物水平（AORambient）观察到AOR变化了3个数量级，从0.5到4000nM d-1（图1）。在河口，陆架和海盆采样点观测到三种不同类型温度响应的AORambient模式：（Ⅰ）Topt≥34℃时为正响应（图1a，b）；（Ⅱ）Topt≤14°C时的负相应（未见报道）（图1d-f）；（Ⅲ）Topt在20-29℃时的圆顶状响应（图1c，g-i）。
在3个河口采样点中，有2个都观测到了模式Ⅰ，铵浓度很高（≥24 μM），且AOR从14-34℃范围内呈线性增长。模式Ⅰ的Topt等于或高于最高实验温度34°C（图1a，b）。在陆架采样点（N1，M1，和M2）中都观测到了模式Ⅱ，铵浓度范围为45-550nM（图1d-f）。与模式Ⅰ相反，模式Ⅱ的Topt≤最小温度14℃，随温度增加展现出AOR连续下降的过程。在观测点JLR3（外河口），N2（陆架），N3和J1（盆地）观测到了模式Ⅲ，Topt在20到29℃之间进行变化，不管温度是升高还是降低，AOR速率都在下降。模式Ⅲ的铵浓度范围为14-5000nM。然而，在最高环境铵浓度的海岸点观测到了最高的Topt值。
2. 底物调节AOR及其热最优温度
对于铵盐浓度较低的采样点，当底物富集时，原位温度下的AOR会增加（AORenriched，添加2000 nM的15NH4+）（图1f，i）。同时AOR下的Topt也向更高的值显著转移（t检验，p＜0.05；图1d，f，g，i）。尽管孵育实验中的温度间隔的分辨率不够高，无法确定AO群落准确的Topt，但氨富集导致的正Topt转变是显而易见的。为进一步探索海洋环境中底物如何调节AOR的Topt，采用采样点J1（底物匮乏的海盆）和JLR4（底物丰富的上游河口）的样品，针对不同底物浓度设计了Michaelis-Menten（MM）热动力学实验。结果揭示了在给定温度下，AOR对底物浓度的响应可以通过经典的M–M曲线来拟合（图2a，b），即速率随NH4+浓度的增加而增加，直到底物饱和为止。这些M–M曲线与温度有关，最大速率（Vmax）和半饱和常数（Km）随着温度的升高而增加，直到达到饱和最佳温度（Topt-sat）（图2c-f）。需要注意的是，Topt-sat被定义为饱和底物水平上的Vmax的最优温度（Topt-sat，J1为~26℃，JLR4为~29℃；图2c，d）。
根据以上结果，在饱和底物浓度下，来自实验室培养的单一物种的Topt-sat可能并不能代表实际环境中的Topt，因为实际环境中铵浓度并不总是饱的。根据一些已公开的具有硝化成员的生物地球化学模型，发现在温度达到Topt前，硝化作用都遵循着Arrhenius关系。但这些模型中的Topt通常是饱和底物浓度（Topt-sat）下培养的纯实验室培养物，这可能导致在实际海洋暖化中环境不饱和底物浓度下的速率被高估。
为了检验温度和底物对AOR和Topt的相互作用，采用了由Davidson等人开发的Dual Arrhenius和Michaelis-Menten动力学模型（DAMM）。用Km(Q10Km)和Vmax(Q10Vmax)（图2c-f）来表示温度灵敏度。在这个模型中，速率由四个参数决定，即底物浓度，温度，Q10Km和Q10Vmax。通过将采样点J1和JLR4得到的Q10Vmax和Q10Km值引入DAMM模型，模拟了AOR是如何协同响应底物和温度的（图3）。之后通过DAMN模型，又成功地预测了各种铵浓度水平下Topt-sat的AOR（图3a，b）。此外，还通过DAMM模型开发了Topt模型，以预测各种底物水平的Topt。对于Topt模型，在Q10Km>Q10Vmax的标准下，Topt随着底物浓度的增加而增加。这一标准在J1和JLR4采样点都有表现（图2c-f）。可以看出由于添加了铵，Topt的正位移（在J1点高达~100nM，在JLR4高达~10μM）可被精准预测（图3c，d）。总体而言，除非操控的温度超过Topt-sat，DAMM模型可以成功预测整个热响应曲线，包括速率和Topt（图3）。当温度高于Topt-sat时，AOR会显著下降，因此受热损害的生物酶活性可能会导致Vmax（Km）值与温度之间的关系偏离Arrhenius定律。
底物依赖的热最佳状态与温度对酶的生化动力学效应和酶的结构稳定性有关。温度升高会提高酶催化速率，由于反应物的动能和碰撞速率均增加，以及酶结构灵活性的提升，导致Vmax增加。但是，较高的结构灵活性（较低的稳定性）也就意味着活性位点的配体识别和结合能力降低，因此动力学效率降低。于是，生物体对温度升高的一种重要的生理反应是底物亲和力降低，这就需要更高的底物需求（像更高的Km值）。换句话说，较高的底物水平有助于补偿酶结构稳定性的损失，从而促进较高温度下的生长速率。需要注意的是其他一些微生物对温度的响应可能不同，例如Q10Km≤Q10Vmax。
类似地，先前有报道过纯培养浮游植物生长时Topt的营养依赖模式。例如，海洋硅藻生长的Topt是主要养分（硝酸盐和磷酸盐）浓度的饱和函数，相对于饱和养分的Topt，低浓度养分下的Topt可降低3–6°C。除了对纯培养物的研究外，实地研究也表明，当营养物质丰富时，生物体可以耐受较高的温度胁迫。例如，具有高氮储备的海带（Laminariasaccarina）具有更多的热适应能力，而具有受磷酸盐限制的共生体的珊瑚则更易热失活。尽管这些例子在功能和分类上均与AOA和氨氧化细菌（AOB）背离，但极相似的底物/营养调节特性可能暗示化学自养生物和光自养生物之间酶热反应的相似机制。
但是，河口系统（例如JRL1，JLR2和JLR3）中AO的热最优值比近海环境（例如N3和J1）中更高，可能是受基质调节的Topt造成的。值得注意的是，实地环境的AOR明确表现出是由AOA和AOB组成的AO群落塑造的，这些AO群落对底物可能具有独特的耐热性和亲和性。因此，除了底物浓度外，群落结构很可能在实地环境中调节群落AOR的热响应模式。将在后续对此进行研究。
3 速率比例和群落最优温度
为了进一步检查群落结构（AOA和AOB的比例）在多大程度上影响实地观察到的群落AOR的热响应模式，添加烯丙基硫脲（ATU）来抑制AOB活性带来的的速率偏差。结果表明，随着离岸距离的增加，AOR的抑制效率逐渐降低（图4）。也就是说，从河口（JLR4，JLR1，JLR2和JLR3）到陆架（N1和N2）和海盆（N3），AOB对群落AOR的相对贡献度从上河口的~100%（最高）下降到陆架过渡带的~70%，直到盆地的将近0%。同时，从河口到海盆的AOA / AOB基因拷贝数据（图4）也表明，相对于AOB，AOA的丰度随着离岸距离的增加呈指数增长。在其他地区，例如从珠江口到中国南海，从切萨皮克湾的淡水地区到沿海和远洋水域，也观察到了类似的近海微生物群落分布格局。这种模式表明，AOB强烈偏好底物丰富的生态位，而AOA则相反，这与上述M-M实验数据一致，即JLR4点AOB主导的水体底物饱和情况比J1点AOA主导的水体要高出几个数量级。在10至37°C的温度范围间，JLR4中AOB的Km值随温度的变化范围为7至55 μM，而J1在相似的温度范围内AOA的Km值在13-44 nM之间。该结果支持以前的纯培养实验和实地研究结果，该研究表明AOB的最低铵需求量>1 μM，Km值范围为28至4000 μM，而AOA的最低铵需求量和Km值分别<10和133 nM。
AOA的低Km值表明在AOA为主的盆地区域，周围底物的浓度很容易达到饱和状态，因此，很可能在26°C左右时， Topt会接近Topt-sat的圆顶状热响应模式，这与实验室中培养的AOA分离株的情况一致。同时，与报道中纯培养物中AOB的Topt-sat在29-35°C范围内相似，本研究的AOB的Topt-sat约为30°C（图1a，b，3d）。由于AOB主导的JLR4随着底物的变化表现出宽范围的Topt，因此当将底物稀释到几μM水平以下时，在10至30°C的温度下可以观察到负响应模式，从而模拟了水体向海对流并随之稀释了底物的过程。因此，推测在实地观测到的三种类型的AOR热响应模式是AOB和AOA沿底物梯度组合的热响应模式造成的。这种负响应模式仅在本研究中的陆架区域和稀释实验中出现。这表明，当AOBs在陆架过渡带中主导群落AOR时（图4），由于底物胁迫下的低Topt，群落AOR可能对温度升高产生负响应。实际上，通过比较环境条件（20 nM 15NH4 +）和显著添加示踪剂（2000 nM 15NH4+）之后的群落AOR，可以清楚地看到，以AOB为主的陆架（M2，图1f）比以AOA为主的盆地（J1，图1i）在原位温度下的速率刺激幅度更高。底物添加造成这种不同的速率刺激暗示了底物在陆架上的饱和度较低，其中AOB对AOR的贡献更大。
4 全球变化和未来的硝化作用
随着大气中温室气体浓度的持续上升，大部分海洋的海面温度（SST）会升高。据政府间相关委员会的RCP 8.5方案报道，到2100年，全球平均海表温度（SST）将会上升4°C，相当于每年上升0.04°C。九龙河河口的季节温度（深度1 m）范围为13至32°C。在1960–2010年期间，该研究区域的平均SST升高为0.02°C / y，约为全球平均预测最大增长率的一半。另一方面，南海北部的水文学受到区域气候和局部水动力的影响，包括西部潮流入侵，内波和季风的影响。南海北部上层200 m的水温在不同深度范围为13至31°C，据报道，1975年至2005年间整个研究区域200 m水深的平均温度升高为0.09°C / y。综上所述，该研究区域的水温升高与全球平均水平相近甚至更大，这表明全球变暖的速率与该研究区域基本同步。
利用动力学参数的热响应，尝试评估暖化对AOB和AOA之间竞争的影响。引入特定亲和力（α）的概念，即Vmax / Km的比值，可以用来表示微生物在稀释环境中清除底物的能力。因此，当底物受到限制时，具有较高α值的微生物在竞争中占据优势。结果发现以AOA主导的J1的特异性亲和力高于以AOB主导的JLR4的亲和力（图5a）。此外，随着温度的变化，AOB的α值与AOA相比，变化的范围更狭窄。较小的变量α可能反映出AOB可以更好地应对生境中的温度变化（图5a）。相反，AOA对温度变化更敏感。如在DAMM模型中所提到的，具有底物依赖的Topt的标准是Q10Km>Q10Vmax，这也导致AOA和AOB在升温期间的α值减小。但是，随着温度的升高，AOA的特定亲和力降低更为显著（图5a），这表明相对于AOB，AOA在低温环境中更具竞争力，因此可能不适应变暖的海洋环境。另一方面，AOB的特异性对温度变化不敏感，表明它们在温度波动较大的近岸环境具有很好的适应性。温度波动和铵盐浓度的向海梯度决定了硝化菌的群落，因此，在实地观测到了群落AOR的热响应模式。
为了预测变暖海洋中不同地理空间中AOR的趋势，汇编了可用的海洋AOR数据以检验AOR的变化趋势。如果假设AO群落的生物地理分布保持不变，并且仅考虑相对于实地温度的AOR暖化效应，发现AOR在近岸和离岸的热响应是完全不同的（图5b）。更具体地说，当温度变化增量小于10°C时，这些近岸AO群落中较高的Topt使得海洋暖化促进沿海的AOR。然后，AOR随着温度的进一步升高而下降，这可能是由于上文所述的酶活性受损所致。另一方面，在离岸水体，群落AOR随暖化呈线性下降趋势（图5b），这主要是因为当前的环境温度对于AOA而言接近于Topt-sat，或在低底物状态下高于AOB的Topt。
根据2100年全球平均海面温度升高4°C的说法，近岸系统的AOR可能会增加0.4–30％，平均值为增加13％（图5b）。但是，在当前底物水平下，按海洋温度将升高4°C的说法，低营养环境中的群落AOR将下降13–33％，平均下降27％（图5b）。
研究结果还表明，人为氮素（包括铵盐）在大气中的沉积逐渐增加，可能有助于氨氧化微生物在铵盐缺乏的近海环境中的热适应。但是，由于浮游植物与硝化细菌相比，对NH4+更具竞争优势，因此来自大气中的大部分NH4+将首先被浮游植物利用。如果将这些铵直接提供给AOA生态位，那么近海AOR可能会对到达Topt-sat之前的暖化做出正响应。请注意，AOA更喜欢低温并能适应低底物水平，因此在外海中出现的AOR峰值通常出现在垂直温度梯度也很大的硝化生态群附近。因此，暖化效果对垂直范围内可能具有不同影响。
相反，在AOB主导的浅海近岸，人为NH4+的额外输入无法进一步促进Topt-sat趋势的改变。因此，在近海区域的温度响应是肯定的。根据图4的观测数据，尽管AOB基因的拷贝数要少得多，但除非铵浓度下降到大约数百nM水平，否则AOB是河口中下游，沿海海域甚至陆架区域的主要AOR贡献者。因此，由于AOBs更强的热适应能力以及大陆人为氮输入的不断增加，推测AOBs的生态位空间在未来可能会在陆地-海洋过渡带中进一步扩展。
在富营养化近岸系统和贫营养化离岸区域观测到的不同暖化效应，将对广泛营养层中海洋氮循环的气候反馈产生重大影响。例如，沿海海洋的AOR增加将促进N2O排放。实际上，实地调查和实验室培养研究表明，AOB产生N2O的潜力大于AOA。AOB产生的N2O产量约为AOA培养物的两倍。因此，在以AOB主导的AOR近岸地区，N2O的产量可能会进一步提高。这将为全球变暖提供正反馈，而在离岸地区AOR的抑制则会产生负反馈。另一方面，在浑浊的沿海和河口系统的氮再循环期间，增加的AO可能会提高NO2- / NO3-的产生，从而使微生态位中的底物反硝化，这是N2O产生的另一重要途径。因此，暖化和过多的氮输入将进一步加剧沿海海域N2O的排放。
除了气候反馈外，全球变暖对海洋氨氧化的影响也可能改变氮素的分布。据报道，海洋酸化对AO的抑制作用进一步加剧了暖化对AO的抑制作用。在外海的底部富营养区，对AO的双重抑制将通过硝化大大减少将NH4+转化为NO3-的的量，最终有利于较小的初级生产者，这些生产者对NH4+更具竞争力。同时，NO3-支持的初级生产者（例如大型硅藻）将处于竞争劣势。这可能对碳输出到深海不利，因此对全球变暖构成了正反馈。
酸化，分层，脱氧和紫外线等多种环境因素在同时发生变化。为了更好地预测硝化反应如何响应多因素互作的全球变化，将来应该在实验中纳入多个因素。此外，还应在不同水平铵盐下研究硝化两个步骤的实地条件和实验室条件下AO响应以及相关的N2O产量，以评估其对全球变暖的影响。同时，迫切需要基因组和蛋白质组学研究来确定海洋AO生物体物种特异性温度响应的生理机制。除了硝化作用之外，为了提高模型的预测能力，并深入了解氮在微生物生态系统中的生物地球化学作用，还需要研究相关氮过程的动力学参数对温度的敏感性。此外，还需仔细监测微生物在短期实验（例如每小时的操控）到长期实验（数十年）对环境变化的响应。需要对海洋硝化细菌进行类似的长期实验（成千上万次），以探索其面对未来海洋中铵供应和温度的同时变化时，发生进化适应的可能性。
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