科研 | Nature Microbiology:原位宿主-微生物相互作用的空间代谢组学

编译:小范儿,编辑:小菌菌、江舜尧。

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导读

空间代谢组学描述了自然群落中参与代谢表型、防御分子和化学相互作用的小分子的位置和化学性质。目前大多数技术都无法在与微生物相互作用相关的尺度上将微生物的基因型和代谢表型在空间上联系起来。文章介绍了一个空间代谢组学管道(metaFISH),结合荧光原位杂交(FISH)显微镜技术和高分辨率大气压基质辅助激光解吸/电离质谱技术来成像宿主-微生物共生微生物及其代谢相互作用。metaFISH管道以微米为单位排列和整合代谢物和荧光图像,以在同一组织切片上提供宿主和共生体代谢物的空间分配。为了说明metaFISH的优势,以单个上皮宿主细胞的规模绘制深海贻贝及其细胞内共生细菌的空间代谢组图。我们的分析管线揭示了上皮细胞对细胞内共生体的代谢适应,以及单个共生体16S rRNA系统型内代谢表型的变化,并使我们能够从宿主-微生物界面发现特化代谢物。metaFISH提供了一种与培养无关的方法,将代谢表型与原位群落成员联系起来,是跨领域微生物学家的有力工具。

论文ID

原名:Spatial metabolomics of in situ host–microbe interactionsat the micrometre scale

译名:原位宿主-微生物相互作用的空间代谢组学

期刊:Nature Microbiology

IF:14.3

发表时间:2020.2.3

通讯作者:Manuel Liebeke

作者单位:德国不莱梅马克斯·普朗克海洋微生物研究所

实验设计

该研究设计一个空间代谢组学管道(metaFISH),结合荧光原位杂交(FISH)显微镜技术和高分辨率大气压基质辅助激光解吸/电离质谱技术来成像宿主-微生物共生微生物及其代谢相互作用。利用metaFISH研究鳃代谢物中细菌定植和无细菌组织的亚代谢物的空间分布。并对特定代谢物进行研究证明metaFISH在分子勘探方面的潜力。

结果

以3 µm MSI像素大小将AP-MALDI-MSI和FISH应用于同一组织切片,可改善微生物学中的空间代谢组学,从而能够以与微生物相互作用相关的尺度共同鉴定代谢物和细菌系统型(图1a)。使用术语``系统型''来指代具有高度相似的16S rRNA基因序列(> 99.9%)的共生体。为了分析相关的荧光和代谢物图像,开发一种基于FISH的空间代谢组学分箱方法,将其命名为成像和分析管道metaFISH。metaFISH流程包括以下三个模块:(1)样品制备和成像(图1a,b);(2)相关成像数据的处理(图1c-f);(3)使用荧光信号对代谢物组进行分类的统计分析(图1g和2c)。管道提供相关值(metaFISH ratio (MF ratio)),表明哪些代谢物与宿主或共生组织在空间上相关。使用这些宿主和共生体分配值来解释通过分子网络可视化的化学空间,并指导液相色谱与串联质谱(LC-MS / MS(也称为LC-MS 2))测量来验证AP中标注的代谢物-MALDI-MSI数据(图1g,h)。

图1.在相关的成像和分析管道(metaFiSH)中结合空间代谢组学和分类单元特异性标记

1.   成像细胞内微生物群落及其空间代谢组的关键方面。

建立与FISH和AP-MALDI-MSI相关的管道需要从样品制备到成像的方法学开发以及最终的相关数据分析方案。首先必须确保高分辨率AP-MALDI-MSI成像的代谢物模式是生物起源的,而不是人工制品,由于没有标准化的程序来确保MALDI-MSI的质量,我们为高分辨率AP-MALDI-MSI 27调整了方案,将代谢物的扩散,渗漏和涂污降至最低,并获得足够强的代谢物信号。将这两种技术应用于相同的组织切片,从而能够对来自相同细菌细胞的代谢物和FISH信号进行真正相关的映射。在FISH之前使用AP-MALDI-MSI(图1a,b),以避免样品化学性质改变。为了保留AP-MALDI-MSI后未固定的组织,开发MSI后固定方案,并使用多个标记探针和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)增强FISH信号(图2)。像素大小为3 µm的高分辨率AP-MALDI-MSI无法解析平均细菌细胞(〜1 µm),但可以区分宿主(图2j–o)和共生体(图2p–r)的代谢产物相同的细菌细胞。在相同组织表面上进行FISH是解释这些共有细菌细胞代谢组的关键。由于3 µm MSI分辨率的下限,我们无法统计分离两种共生系统型的亚细胞代谢组。然而,使用FISH显微镜,可以可视化每个细菌细胞群落的系统型组成,并解释宿主及其内共生体的共享代谢组(图2d–r)。

图2.贻贝鳃内的细胞内微生物群落及其空间代谢体

2.   细菌丰富和无细菌组织的代谢产物分配。

metaFISH揭示了鳃代谢物中细菌定植和无细菌组织的亚代谢物的空间分布。经过预处理后,我们的AP-MALDI-MSI数据包括跨越54,289像素的2,506张代谢物图像。使用空间感知聚类方法,我们将鳃的所有分子分布分成七个具有不同生物化学特征的聚类(图3a,d)。空间聚类还从组织相关代谢组(簇2、4、5、6和7;)中分离了化学背景信号(簇1和3;见图5c中的离子图)。这种化学背景噪声对于源自电离基质的AP-MALDI-MSI是常见的,该基质是施加到样品表面的结晶层。在进行相关分析之前,将FISH图像与MSI数据进行空间对齐,并使用参数来补偿两个数据集之间的差异。从对齐的成像数据集中,计算MF比率,该比率描述了代谢物簇区域和荧光信号之间的重叠。使用MF比率作为一个指标,来判断一个簇是否与无菌组织或含有共生细菌的组织相关(图3b;)使用基于灰度值的图像分割描绘宿主和共生体的明亮视野和荧光显微镜信号。空间聚类提供了一种图像分割方法,可将2506个离子图像划分为7个空间亚代谢物,而无需人工组织注释。我们的metaFISH分析发现了3个与宿主相关的(MF比<1)和4个与共生相关的(MF比> 1)亚代谢物,包括分配给簇1和3的背景信号(图3b)。精确的FISH图像相关性使我们能够将簇分类为细菌亚代谢产物,即使它们由分散在整个组织中的几个像素组成。通过独立的AP-MALDI-MSI分析或目测,这种视觉上随机的代谢物和簇分布将被视为非结构性噪声。将来,对于真核生物和细菌的单细胞代谢体的研究,通过标签特异性的相关技术来支持异质、低丰度的代谢模式的识别将是区分噪音和有意义的生物信号的关键。

图3.基于FISH信号的空间代谢组别

3.   MOX内共生体的独特代谢表型的可视化。

代谢产物的成像可以揭示表型异质性;例如,在同一微环境中同时发生的克隆群落中。空间代谢组在单个细菌细胞的规模和细菌群落结构的同时可视化,使我们能够研究内共生MOX细菌的原位表型。我们的metaFISH管线揭示了MOX系统型的空间代谢组中的变异,尽管事实是所有腐烂芽孢杆菌MOX共生体都属于单一系统型。在类metaFISH分类的细菌簇6和7中鉴定出类胡萝卜素是一组独特的MOX特异性代谢物。类胡萝卜素是通常在MOX细菌的膜中的脂质,尚不知道在SOX细菌中存在,包括腐烂芽孢杆菌中的SOX共生物。类胡萝卜素通常被用作生物标记物,因此我们用它们作为代理来定位腐烂假单胞菌中的MOX共生体。出乎意料,与MOX共生体的16S rRNA FISH信号相比,微米级类胡萝卜素分布图显示出单个类胡萝卜素的零散分布,并且揭示了单个宿主个体的MOX共生体之间的类胡萝卜素明显不同(图4)。空间聚类分析支持了我们的成像分析,揭示氨基紫杉醇-三醇(聚类6)和细菌紫杉醇-四醇(聚类7)的分布存在显着差异(图4a)。

许多代谢物没有聚集。因此,为了将更多的代谢物归类为类胡萝卜素,使用化学网络方法将AP-MALDI-MSI数据可视化。在MSI数据采集过程中,检测到未破碎的代谢物,这使得我们能够将两个化合物之间的确切质量差异转化为确定的化学修饰。这些改变被可视化为边缘,并将单个代谢物连接成网络中的节点,突出显示网络中的空间簇和化合物注释后,发现了另外两个类胡萝卜素,即氨基细菌类胡萝卜素-四醇和无水类细菌类胡萝卜素-四醇,它们直接连接到两个空间聚集的类胡萝卜素(图4a)。

我们发现氨基细菌-鹅肝素-三醇和氨基细菌-鹅肝素-四醇之间存在明显的空间差异(图4b-d),尽管它们在单个羟基上的化学差异很小(参见图4a中的分子网络)。两种类胡萝卜素均分散分布,氨基细菌类戊四醇位于鳃的外边缘,而氨基细菌类戊三醇集中在中心的单个细菌细胞中(图4b-d)。众所周知,微生物群落会在米长的氧气梯度上改变其类胡萝卜素成分。因此,从鳃的边缘到鳃的中心,两个类胡萝卜素相对丰度的逐渐变化(图4e)可能反映了细胞内MOX共生体对这种微尺度梯度的表型适应。通过我们的相关成像管道,我们可以发现不同的hopanoid表型是由单一的共生系统型表达的,并且在鳃组织中呈现出明显的分布。因此,metaFISH可以检测生物标记分子分布中表型异基因的存在。

图4.鳃内MoX共生体的空间代谢异质性。

4.共生器官的代谢情况

除了呼吸器官的作用外,它的鳃还具有生物反应器的功能,其中巨大的共生生物量生长在细菌细胞中。这个共生器官的空间代谢组学仍然是未知的。我们发现,在有共生菌的区域和没有共生菌的区域之间,鳃的整体脂质组成存在显著差异。与任何静态(体外成像)方法一样,在没有预先标记实验的情况下,无法确定宿主的特定代谢物是被共生体修饰还是被宿主代谢。但是,许多代谢物在化学和空间上相互关联,因为它们参与相似的代谢途径。在AP-MALDI-MSI网络方法中探索这些化学关系,整合所有2506个检测到的分子,并强调宿主相关和共生相关的簇(图5a)。

整个化学空间被分成两个主要的子网络,分别将组织代谢物(簇2、簇4、簇5、簇6、簇7)与背景(簇1、簇3)分离(图5a)。利用MSI代谢物注释平台METASPACE,注释的和组织相关的代谢物大部分是磷脂,如磷脂酰脂系(PCs),这是真核生物的主要膜成分(簇2和簇4;图5 b, c)。 PC(36:2), C44 H84 NO8P+H+ ,m/z = 786.601和 PC(32:1), C40 H78 NO8P+H+ , m/z = 732.5543沿每个细丝均匀分布(Fig. 5c)。在簇2中,超过60%的离子共享这种分布,这可能代表了鳃组织的基本代谢组学特征。我们数据集中来自最大的细菌特异性亚代谢组(第7组)的大多数代谢物都标注为甘油三酸酯(TGs)。并具有与TG(48:3),C51 H92 O6 +Na+,m/ z = 823.6794和TG(52:3),C55 H100 O6 +K+m / z = 895.7142相似的分布(图5d)。这些TG形成了与富含磷脂的组织子网络不同的独特化学子网络(图5a)。化学网络中磷脂和TGs的分离可能与这些脂质在活细胞中的功能差异有关。磷脂是膜结合的,而TGs是由磷脂膜的翻转和降解合成的储运脂质。细菌在细胞内的消化需要分解细菌的磷脂膜。我们观察到的细菌区含有高TG丰度的空间亚代谢物可能来自于宿主对内生菌的胞内消化。

在无菌纤毛缘组织中,我们定位了一种磷酸盐脂质,即磷乙醇胺神经酰胺(34:2),c36 H72 N2O5 P, m/z = 643.5170(图5c),磷酸盐是一类研究较少的代谢物,是某些海洋细菌的磷和氮的来源,PnE-Cer(34:2)集中在有纤毛的边缘和鳃的中央。这种常在海洋软体动物中发现的脂类的存在,可能代表了磷酸盐降解物的潜在生态位。在紧密相关的水深海贻贝物种中,在纤毛边缘定殖的依附生物拥有降解膦酸酯的基因。我们发现第4类簇中的宿主代谢产物在无共生纤毛边缘高度丰富,并朝着定殖组织逐渐减少(图2b)。在这组共定位的代谢产物中,我们鉴定出PC(34:3),C42 H78 NO8P + H+,m / z = 756.5536(图5b;)。PC(34:3)与细菌的存在负相关。PC可以由10%的细菌合成,一些细胞内细菌可以清除PC作为胆碱源。我们假设像PC(34:3)这样的分布模式表明宿主代谢产物合成的减少或细菌细胞中细胞内共生体的降解。

图5.共生器官的代谢情况。

5.  从与metaFISH的宿主-微生物界面中筛选特定的代谢物。

化学生态学和天然产物发现的关键挑战是确定在宿主-微生物关联中测得的成千上万种代谢产物中的哪些发挥调节作用并具有代谢活性。AP-MALDI-MSI提供了一个功能强大的工具,可以筛选宿主-微生物界面中的代谢物,以作为重复和结构解析的候选对象,metaFISH通过将AP-MALDI-MSI引导至宿主-微生物界面来筛选单个真核细胞规模中可能参与共生相互作用的代谢物,从而促进了天然产物的筛选。

为了证明metaFISH在分子勘探方面的潜力,我们选择m/z = 869.5375(代谢物1)(簇 2; c46 H73 N6 O10,m/z = 869.538265±0.005ppm;)为例。这种代谢物是宿主-微生物界面中含量最高的代谢物之一,仅存在于由共生菌定殖的组织中(图6a)。LC-MS /MS分析证实,代谢物2-5与代谢物1类似,含有一个戊糖片断和一个长度可变的末端脂肪酸(图6d)。

在网络中,离子m / z = 577.2604(代谢物6)通过脂肪酸的不同与代谢物1-5相连(请参见图6d中的网络)。代谢物6是类似物,其组成与代谢物1-5(C26 H37N6 O9,m / z = 577.261659±0.01 ppm;)相似,但缺少脂肪酸(图6d),e)。代谢物6可能是从中裂解了脂肪酸的代谢物1-5的产物,或是与脂肪酸连接的前体分子。高空间分辨率的MSI显示,宿主分配的代谢物6分布在代谢物1-5周围,这些代谢物集中在细菌细胞中(图6c)。

用metaFISH查找代谢物1–6,我们筛选了11种化学合成的深海软体动物物种分别是:Bathymodiolus(7种),Gigantidas(3种)和Vulcanidas(1种)。这些贻贝物种中的一些,例如Bathymodiolus,包含SOX和MOX共生体,而其他仅包含MOX或仅包含SOX共生体。所以能够测试代谢物1-6是否对共生体-宿主关联具有特异性。仅有SOX共生体的贻贝中没有代谢物1-6。相比之下,当存在MOX共生菌时,在Bathymodiolus和Gigantidas中总是发生元代谢产物1-6。为了测试在自由生存的MOX细菌中是否存在与水生贻贝的MOX共生密切相关的代谢产物1–6,我们筛选了甲基谷底沉积物的细胞提取物,发现了代谢产物6的痕迹,但没有发现代谢产物1–5的痕迹。在代谢物数据库中进行手动和自动搜索后,我们没有找到代谢物1-6的数据库匹配项(请参见方法)。此外,重复数据删除管道(全球自然产品社会分子网络(GNPS))没有提供与任何公共MS数据集中的代谢物1-6匹配的结果。

我们使用metaFISH筛选宿主-微生物界面后,发现一组代谢物似乎对共生体和贻贝物种之间的贻贝-MOX细菌相互作用具有特异性。数据库搜索和代谢物的分子表征表明迄今未知的化学结构。因此,代谢物1–6代表结构阐明的主要候选物,以确定共生体及其功能内的生产者。我们的metaFISH管道为常规次级代谢物筛选提供了宝贵的补充,可根据微生物和宿主相互作用的位置来确定目标代谢物的数量,而不受代谢物丰度的影响。

图6. metaFISH代谢物筛选显示了一组特定于贻贝-MoX共生体相互作用的代谢物,可作为结构阐明的候选物。

结论

将空间代谢物与多成员群落的个体伙伴联系起来,例如宿主与微生物的联系,可以深入了解它们之间的代谢相互作用。代谢物成像与FISH结合可在微生物的代谢组与其系统发育身份之间建立联系。微生物菌株和真核细胞的测序可用于设计标签,靶向单个基因或转录本,并与MALDI-MSI结合可提供更高的基因型和表型之间的空间相关性分辨率。

metaFISH允许结合MALISH-MSI进行高分辨率MALDI-MSI分析,以将代谢组与单个真核宿主细胞或50-100个细菌细胞的小片段连接起来。鉴于技术在空间分辨率方面的快速发展,代谢物成像有望在不久的将来达到分辨单个细菌的能力。随着代谢物成像空间分辨率的提高,相关的方法将变得更有价值,以揭示共生群落的贡献,并将真核细胞和原核细胞的分类学特征与它们巨大的表型异质性联系起来。

研究人员开始将MALDI-MSI应用于实验室条件可控范围之外的自然环境样品。植物和动物组织通常与微生物有关,微生物对宿主的代谢有重要影响。如果这些微生物被忽视,它们对空间代谢组的贡献将仍然是模糊的,并被错误地认为是一种宿主表型。将metaFISH应用于宿主与病原体的相互作用,可以同时观察病原体的表型和宿主的代谢免疫反应。我们设想metaFISH将扩展现代元组学的功能,以将微生物群落成员的身份与其代谢联系起来,并使我们能够解读彼此之间以及与宿主之间微生物的化学语言。



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