科研 | Microbiome：厌氧条件下产甲烷过程如何进行？ / 四六文摘

编译：寒江雪，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

产甲烷过程是一种由复杂的微生物群落介导的生物过程，因为它对全球变暖的贡献和在生物技术中的应用而备受关注。本文利用宏基因组和宏转录组技术，揭示了微生物厌氧产甲烷代谢的核心机制。研究人员证明了底物只有乙酸盐的，一个以细菌为主的微生物群落可以利用多营养化完成产甲烷过程。

在添加H₂后，微生物的群落结构和功能发生改变。

① Methanosarcina thermophila是加氢前的优势产甲烷菌，通过缩醛、氢营养化和甲基化产甲烷。加氢后刺激了甲烷菌的活性，产甲烷模式发生了改变，甲烷杆菌逐渐被富集。

② 细菌中Wood-Ljungdahl途径中关键基因没有表达，而甘氨酸裂解系统的基因高表达，表明乙酸代谢的替代代谢途径被激活，并且在丰度最高的细菌基因组中重建了该途径。

群落中的特定微生物之间形成了互养关系，从而减少个体成员的生物合成负担。这些结果将有助于未来在产甲烷生态位微生物物种间竞争和共生关系的研究。

论文ID

原名：Metabolic dependencies govern microbial syntrophies during methanogenesis in an anaerobic digestionecosystem

译名：厌氧消化系统产甲烷过程中微生物合成依赖于代谢途径

期刊：Microbiome

IF：10.465

发表时间：2020.2

通讯作者：Irini Angelidaki

作者单位：丹麦技术大学

实验设计

本研究在反应器中接种嗜热沼气厂的沼液，反应器中加入只有乙酸作为有机碳源的培养基。达到稳定状态后注入H₂，分别在加氢前，加氢后18小时和加氢后36天（取样点1、2和3）取样，每个样本三次重复，对样本进行产甲烷相关指标测定及宏基因组和宏转录组测序相关分析。通过宏基因组组装基因组，并对其进行分类学注释，利用宏转录组分析微生物群落结构和转录活性的变化。

结果

1 乙酸和H₂富集的产甲烷微观结构

沼气反应池在乙酸作为唯一有机碳源在高温条件下运行，获得易于处理的低复杂度的产甲烷微生物群落。加H₂前后，取样点1和3，三个反应器运行稳定并无显著差异，取样点2由于是在加H₂前后的过渡过程，微生物群落不稳定，三个反应器间存在显著差异。主要的消化产物有CH₄和无机碳化合物（包括CO₂、碳酸氢盐（HCO₃-）、碳酸盐（CO₃²-）。消化曲线描述每种产物中所含的碳摩尔数（图1）。大约4%的碳用来建立微生物的生物量，甲烷化过程效果明显，只有不到0.5%的碳以未消化的乙酸盐的形式离开体系。加入的H₂被完全消耗，甲烷产率由299.8±4.4mL/g乙酸显著提高到409.3±14.6mL/g乙酸。

图1 反应器中加氢前后的消化曲线。左侧条形图表示提供给系统的碳源。据甲基辅酶M还原酶基因(mcrA，alpha unit)的表达水平，将CH₄的产生活性分配到5个宏基因组组装的基因组(MAG)中。

2 宏基因组组装的基因组重建与分类学注释

所有样品的序列通过合并组装自动进行bin，以提取宏基因组组装的基因组。共提取了79个MAG，总覆盖率为5×~9595×（图2）。其中有36个高质量MAG，25个中等质量MAG，18个低质量MAG。大于95%的序列都可以比对到高质量的MAG，说明通过组装和bin复原了大部分微生物多样性。群落中有5个组装比较完整（>98%）的古菌，其中4个鉴定到种水平，分别是Methanothermobacter thermautotrophicus DTU592，, Methanosarcina thermophila DTU593，Methanoculleus thermophilus DTU608和Methanobacterium sp. MB DTU624。未分类的Methonommicrobia DTU639可分类到纲水平。56个细菌MAG中有51个能在科或更高的分类水平上被分类。从相对丰度来看，18个丰度最高的MAG可以组成微生物群落的90%以上，其中有15个属于细菌。其中，有4分类为Firmicutes，2个分类为Bacteroidetes，2个Synergistetes，2个Proteobacteria和1个Thermotogae，其余4株为未分类菌种。

图2 宏基因组组装基因组及其系统发育关系。（a）79个MAG的系统发育树。（b）CheckM评估的完整性和污染值。（c）MAG质量。“H”代表高质量，“M”代表中等质量，“L”代表低质量。（d）基因组大小和N50值。（e）每个MAG在9个样本中的平均覆盖率和RPKM值。（f）分类学注释。（g）门水平的分类学分类。

3 微生物群落组成与转录活性

利用每个MAG的基因组平均覆盖率和所有编码蛋白基因的平均基因表达水平来确定微生物群落组成和转录活性表达谱（图3）。目前认为乙酰裂解产甲烷菌（M. thermophila DTU593）理论上可以承担大部分乙酸甲烷化过程，但是因为只有产甲烷底物（乙酸和H₂-CO₂）推动了这一过程，五种产甲烷菌只占整个微生物群落的小部分，占总丰度的19-37%，活性的7-27%。在添加H₂之前，整个微生物群落中丰度最高的MAG（DTU593）分类为Methanosarcinathermophila，相对丰度占总群落的17%，活性的5.3%。DTU593 RNA/DNA比值相对较高，说明它具有较高的细胞蛋白质合成潜力，在此条件下可能有较高的生长速率。相对丰度第二和第三的是未分类细菌DTU645和未分类Synergistaceae sp.（DTU638），丰度各占群落的12%，活性分别占19%和18%。加H₂后，微生物丰度和转录活性发生显著变化。变化最显著的是Coprothermobacter Proteolyticus DTU632，它成为丰度最高的MAG，占群落总数的19%，但活性贡献率仅为6.8%。

图3 微生物群落组成和转录活性谱。内蓝圈表示每种MAG的相对丰度，中间红圈表示每个MAG的相对活性，最外圈表示相对丰度和活性的比较。

4 产甲烷菌的代谢

反应器唯一的有机碳源乙酸通过两条途径被微生物吸收：1）反向磷酸转乙酰化酶-乙酸激酶途径（PTA-ACKA），2）AMP形成乙酰辅酶A合成酶途径（AMP-ACS）。因此，可以根据MAG特异的乙酰辅酶A合成酶(Acs)和乙酸激酶(Ack)基因的表达水平来估计单个微生物对乙酸的利用。消耗乙酸最多的古菌是DTU593，加入H₂之前，消耗通过反向PTA-ACKA途径提供的乙酸盐的不到50%。加入H₂之后，M. thermophila的特异ack基因表达水平显著降低，而细菌ack的表达水平显著升高。考虑到CH₄是由5个古菌产生的，根据MAG特异的mcrA的表达水平，初步将产甲烷活性分布在5个古菌中（图2）。加H₂之前，DTU593（86%）和DTU608（11%）活性最高。达到稳定状态后添加H₂，导致了向营养化产甲烷的代谢转变， DTU608的活性明显提高，成为了群落中最主要的产甲烷菌。试验最终稳定结束时，56±0.4%的乙酸碳转化为CH₄。适应H₂后，虽然DTU608依然保持了优势，但是相当大的产甲烷活性被DTU593和其他氢利用产甲烷菌取代。

在所有古菌MAG中都重建了与产甲烷相关的途径，同时保持能量守恒系统（图4）。DTU593中表达的基因与氢营养，甲基化和乙酸发酵型甲烷化，表明其在厌氧消化中具有多种营养功能。DTU593通过甲基吩嗪还原氢酶(Vho)、辅酶F420还原氢酶(Frh)和大肠杆菌氢化酶3(Ech)从中间体H₂获得电子保证能量守恒。

DTU608的产甲烷活性仅限于氢营养途径。DTU592和Methanobacterium sp.的相对丰度和活性只在后期升高，并且编码了与DTU608相似的氢营养型甲基化途径。

图4a 五种古菌产甲烷途径的重建。b 与产甲烷相关基因的表达。

5 细菌的代谢

超过50%的乙酸盐没有被古菌吸收，而是被群落中的细菌代谢掉。细菌采用多种策略将乙酸盐转化为甘氨酸，进一步代谢甘氨酸裂解系统释放的中间产物，同时保持能量守恒。基于丰度最高的消耗乙酸的细菌MAG中高表达的基因提出了乙酸降解途径（图5）。在Bacteria sp. DTU645中重建了Thermotogae-like的乙酸利用途径，该菌株在系统发育上与Firmicutes聚为一类（图1）。介导亚甲基四氢叶酸的基因簇在C. proteolyticus DTU632基因组中缺失，C. proteolyticus是一种蛋白水解菌，主要发酵产物是乙酸，CO₂和H₂。但是在本研究中，它的相对丰度和活性很高，这表明它参与了乙酸代谢，并产生了H₂。C. proteolyticus可以代谢氨基酸，根据高表达的基因，推测在DTU632中重建了类似Stickland反应（图5）。

图5 三种丰度最高的菌的乙酸利用途径。

6 微生物群落的整体代谢

通过互养关系来维持微生物群落的产甲烷活性，进而合成大量的代谢物。通过每个KEGG模块中基因的平均RPKM来评价微生物群落的整体活性。添加H₂后，大多数KEGG模块的微生物活性发生了整体的变化。虽然每个MAG的丰度和活性在不同的时期有明显的变化，但普遍存在的代谢途径对于维持复杂的微生物群落是必不可少的。优势菌群在添加H₂之前进行的关键代谢可以通过添加之后的其他增殖的物种来维持。对每个MAG的表达谱的研究发现，共性辅因子如辅酶A、NAD和核黄素的生物合成在优势微生物中表达均匀，但是一些MAG缺少几种耗能的氨基酸和辅酶因子的生物合成。（图6）。C. proteolyticusDTU632缺乏有效的电子处理途径和能量高效的醋酸分解代谢途径，但表现出较高的还原柠檬酸循环活性。因此，C. proteolyticus可以作为高耗能的氨基酸营养缺陷菌生长，以降低生物合成负荷。多种氨基酸转运系统的高表达说明DTU632的生长受到色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等外源氨基酸摄取的支持。而Bacteria sp.DTU628，Clostridiales sp. DTU630和Rhodocyclaceae sp. DTU583的基因表达谱表明这些菌在H₂添加过程中可以合成相应的氨基酸（图6）。

图6 丰度最高的细菌MAG的表达谱和相关KEGG模块

讨论

以基因组为中心的宏基因组学和宏转录组学的结合成功地揭示了微生物成员在产甲烷微生物群落中的个体，结果说明Methanosarcina thermophila可以同时从乙酸、二氧化碳和甲醇/甲胺中生成甲烷。在厌氧消化过程中，中间产物H₂不仅促进了氢营养产甲烷菌的生长，同时也为M. thermophila提供了有利的生态位。M. thermophila具有通过乙酰裂解途径进行产甲烷的代谢潜力，在本研究中形成了一个以细菌为主的多营养产甲烷策略的群落。虽然没有检测到显著的甲醇浓度，但是也证明了甲醇/甲胺产甲烷途径的重要性。所以维持低浓度的相关代谢物（如甲醇/甲胺）在高效厌氧消化系统中可行的。细菌的多种代谢途径在乙酸盐氧化，以及维持微生物群落结构方面都是必不可少的。本研究表明，群落中的许多微生物通过甘氨酸裂解系统绕过乙酸的羰基和甲基碳键的直接断裂。C. proteolyticusDTU632重建了类似Stickland途径代谢氨基酸，而且这种代谢特性可能只有在特定的条件下才能被激活。本研究利用乙酸作为唯一碳源并外加H₂，对C. proteolyticus施加了选择压力，也使得群落构成了互养关系。这一发现为未来研究探索不同环境中的新陈代谢潜力，证明微生物群落中单个成员的功能作用可能超出相应菌株的生理特征奠定了基础。在丰度最高的MAG中缺失一些关键的氨基酸和辅因子的生物合成的转录活性，表明细菌和古菌成员存在潜在碳源、氨基酸和辅因子的交换，也解释了即使在简单的底物上生长也会形成复杂的微生物群落结构的重要原因之一。

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