科研 | IJMS：AtNPR1介导的柑橘黄龙病抗性机制
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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柑橘黄龙病是韧皮部致病菌Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）引起的严重病害，可为害多数柑橘类果树（甜橙、宽皮橘、柠檬、柚），导致果实质量降低，植株衰弱死亡。而枸橼及其及其杂交品种对黄龙病有一定抗性。目前防控黄龙病的方法包括抗生素/抗菌素处理、热处理、树干注射或喷施植物防御诱导剂等。
诱导抗性的机制为激活植株激活水杨酸（SA）信号或系统获得性抗性（SAR）通路，从而提高植株对黄龙病的持久抗性。其中，病程相关基因NPR1是激活系统获得抗病性的重要调控因子。在植株响应病原菌侵染的过程中，水杨酸在细胞中积累，细胞质中的NPR1寡聚物分散为单体，并移动至细胞核内；在细胞核中，NPR1与TGA家族转录因子结合，诱导抗病基因PR1表达，而且TGA基因还有诱导水杨酸防御反应的功能。在拟南芥中，AtNPR1及其同源基因AtNPR3/AtNPR4被鉴定为水杨酸的受体，它们在病原菌响应过程中起独立且相反的调控作用。
NPR1作为植物系统获得抗病性的关键调控因子，使植株具有持久且广谱的抗病性。在水稻中，AtNPR1基因的过表达可增强对水稻白叶枯病的抗性，但也诱导细胞坏死。NPR1及其涉及的途径的其他基因被认为是抗病转基因作物良好的候选基因，被应用于小麦、烟草、大豆等作物。除抗病性外，NPR1在非生物胁迫中也发挥重要作用，在盐胁迫、干旱条件、低温环境下可调节活性氧化物、脯氨酸含量。
研究表明AtNPR1的过表达可增强柑橘的抗性，以及作物的非生物胁迫抗性，在葡萄、胡萝卜、番茄、苹果、烟草等果蔬作物中进行过广泛研究。'Duncan’葡萄柚和'Hamlin’甜橙中过表达AtNPR1可增强对柑橘溃疡病的抗性，本研究利用抗黄龙病的转基因柑橘植株的转录组，具体阐明AtNPR1对柑橘黄龙病的抗性机制。
论文ID
原名：Potential Mechanisms of AtNPR1 Mediated Resistance against Huanglongbing (HLB) in Citrus
译名：AtNPR1介导的柑橘黄龙病抗性机制
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.183
发表时间：2020.3
通讯作者：Manjul Dutt
通讯作者单位：佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
DOI号：10.3390/ijms21062009
实验设计
① 植物材料：甜橙（Citrus sinensis Osbeck）转基因株系过表达AtNPR1（AT1G64280），以卡里佐枳橙（Citrus sinensis Osbeck × Poncirus trifoliata）为砧木嫁接。
② RNA-seq：TRIzol法提取植物组织总RNA，反转录第一链cDNA。约3μg RNA随机片段构建150-200 bp文库，Illumina HiSeq 2000 进行125bp/150bp双末端测序。TopHat将reads比对至甜橙基因组，基因表达水平基于FPKM法计算比对到基因或外显子的reads数目。DESeq筛选差异基因（padj<0.05），并通过BLASTx注释，通过GO/KEGG富集分析。SYBR Green RT-qPCR验证基因表达。
③ 双分子荧光互补分析：带目的基因载体的农杆菌注射烟草叶片，YFP荧光蛋白作为报告基因，验证AtNPR1与靶基因的互作。
④ 酵母双杂交分析：AtNPR1克隆载体携带DNA结合域，靶基因克隆载体携带GAL4激活域，在Y2HGold酵母菌株中验证其互作。
结果
1、差异表达基因鉴定
本研究选择过表达AtNPR1的“Valencia”甜橙植株，将其转录组与非转基因植株进行对比，各3个生物学重复，共构建6个cDNA文库。测序结果显示373.65M reads，质量分数高于Q30占92%，TopHat2进行短序列比对时约76%的reads比对到参考基因组上，表明RNA样品未受污染，且参考基因组选择恰当。RNA-seq结果表明，样品间的整体表达水平的相关系数大于0.85，适于差异表达研究（图1A）。转基因株系和对照株系分别鉴定到表达基因16817和16787个。其中592个基因在AtNPR1转基因株系特异表达（图1B）。DESeq筛选到57个差异表达基因，其中上调51个，下调6个，但有11个基因BLASTx未鉴定到功能（图2A）。上调基因包括5个锚蛋白编码基因，4个机械敏感性离子通道蛋白，4个富亮氨酸受体激酶，以及4个PAMP途径的关键转录因子。下调基因中，3个属于MADS-box基因家族，1个是酮酯酰-CoA合酶，1个是香叶醇羟化酶。KEGG富集分析中有17个差异基因富集在14个代谢通路，然而只有亚麻酸代谢通路的基因有显著差异（图2B）。GO富集分析发现28个功能类别，均没有显著差异的基因（图3）。RT-qPCR验证了11个基因的表达与RNA-seq结果相似，包括环核苷酸门控通道蛋白基因、热休克蛋白基因、富亮氨酸受体丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞壁受体激酶、锚蛋白基因，表明RNA-seq结果的可靠性（图4）。同时，RT-qPCR验证了CsNPR3（病程相关基因非表达子）、CsPR1（病程相关蛋白）、CsSABP2（水杨酸结合蛋白）基因在转基因株系中显著上调，而CsPR2显著下调，转录因子MYB4、NAC68、WRKY70均上调（图5）。
2、AtNPR1与柑橘靶基因的互作
RNA-seq表明柑橘中几种防御相关的基因在AtNPR1的介导下表达上调，故我们进一步研究AtNPR1是否与其柑橘同源基因有相互作用。研究已知NPR1介导SA信号通路，而NPR3和TGA5基因属于该通路。拟南芥中研究表明AtTGA转录因子可与AtNPR1发生互作。本研究用酵母双杂交系统检测AtNPR1与CsNPR3、CsTGA5（转录因子），证明了他们的相互作用（图6）。双分子荧光互补分析同样证明了这一点，黄色荧光即为互作的信号（图7）。
讨论
本研究首次报道了一种抗黄龙病的柑橘转基因株系，并进行转录组分析。转录组、蛋白质组、代谢组有助于发现重要的基因/蛋白质/代谢产物，从而进一步了解柑橘的基因组。先前的研究较多集中于感染黄龙病植株与健康植物的比较，或耐病品种与感病品种的比较。
从本试验筛选的差异表达基因可看出，在AtNPR1转基因株系中，CNGC（环腺苷酸门通道蛋白）、受体激酶、植物防卫反应转录因子基因均表达上调，可能有助于柑橘植株对黄龙病的抗性。① CNGCs是由胞质信号分子（如环核苷酸、钙调蛋白、Ca2+）调控的离子通道。当植物收到机械损伤时，Ca离子迅速内流，使钙调蛋白磷酸化，激活茉莉酸（JA）防卫反应通路。在拟南芥中，AtCNGC1参与了植物的Ca吸收，并影响幼苗根系生长。AtCNGC2和AtCNGC4则参与病原侵染后的PAMP免疫途径。AtCNGC11和AtCNGC12诱导过敏性坏死反应，在SA信号通路和抗病蛋白过度积累时起作用。② 受体激酶是植物的细胞外受体，参与病原菌识别和防御反应激活。。在拟南芥中，富亮氨酸受体激酶可调节油菜素类黄酮、脱落酸、水杨酸的产生，抵抗病原体感染、低温/盐胁迫、蚜虫取食等。在玉米中，一种与细胞壁相关的受体激酶可对玉米大斑病产生抗性。③ WRKY家族转录因子在植物信号转导起重要作用，本研究中表达上调的WRKY70和WRKY51参与植物茉莉酸信号和乙烯信号通路，调控植物防御。而WRKY70对水杨酸通路的激活和茉莉酸通路的抑制是由NPR1基因调控的。同样，WRKY51参与了茉莉酸信号通路的抑制，并调控油酸含量。先前的研究表明AtNPR1在35S启动子或韧皮部特异的AtSUC2启动子下转基因过表达，可诱导WRKY70基因的表达，，触发植物防卫反应，这与本试验转基因株系的结果相同。本试验同时认为环腺苷酸门通道蛋白、受体激酶、以及植物防御反应相关的转录因子的增强表达可提高对黄龙病的抗性。
而且研究发现AtNPR1可与柑橘同系基因CsNPR3、CsTGA5发生互作，因此AtNPR1可能会激活柑橘同源基因以调节植株的防卫反应。综上，本试验认为外源基因AtNPR1在柑橘中可调节水杨酸信号通路，增强植株抗性，保护植株免受黄龙病为害。
结论
本研究试验材料来源于在黄龙病发病率较高的田间发现AtNPR1转基因柑橘植株不受黄龙病侵染，故而对其抗性机制做进一步研究。为确定AtNPR1介导的抗黄龙病的分子机制，通过过表达转基因株系和非转基因对照株系的转录组分析，鉴定了57个差异表达基因，表明病原相关分子模式（PAMPs）编码基因、富亮氨酸受体激酶基因、锚蛋白基因的转录水平增强。蛋白质互作分析发现AtNPR1与CsNPR3、CsTGA5的互作，从而提高柑橘抗病性。结论表明，AtNPR1可有效地提高柑橘的天然防御反应，并有效保护植物免受黄龙病菌侵害。
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