科研 | 加拿大卡尔顿大学学者：冬眠的灵长类动物灰鼠狐猴肌肉中对冬眠响应性microRNAs的分析
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Profiling torpor-responsive microRNAs in muscles of the hibernating primate Microcebus murinus
译名：冬眠的灵长类动物灰鼠狐猴（Microcebus murinus）肌肉中对冬眠响应性microRNAs的分析
期刊：BBA-Gene Regulatory Mechanisms
IF：4.6
发表时间：2019年12月
通讯作者：Kenneth B. Storey
作者单位：加拿大 卡尔顿大学
实验设计
本研究假设miRNAs与促进狐猴骨骼肌冬眠所必需的分子重组事件密切相关。本研究中，小RNA测序被用于比较冬眠的灵长类和正常灵长类骨骼肌中miRNA的差异。研究者共鉴定了234个保守的miRNAs，与对照组相比，其中20个miRNAs在狐猴冬眠期间有差异表达。在这20个差异表达的miRNAs中，就包括重要的肌肉特异性miR-1和miR-133的下调，这意味着向肌肉特异性节能策略的转换。利用生物信息学靶向图谱和基于logistic回归的分析表明抑制能量消耗的途径，如氧化磷酸化和肌肉增殖。这些代谢途径的抑制与多种信号途径（如MAPK、mTOR、focal adhesion和ErbB信号通路）的miRNA抑制的缺乏是平衡的。这项研究发现了独特的miRNA特征和狐猴冬眠的生物标记，为大家提供了高体温的灵长类动物冬眠的特异性见解，这可用于人类的生物医学研究。
结果
小RNA-seq分析和保守miRNAs的鉴定
在所有样本中，高通量小RNA测序共产生63239214个序列。在去除冗余的、低质量的、不符合要求的miRNA后，对照狐猴有12272182个序列，而冬眠狐猴的有12307465个序列。将这些序列与miRBase数据库进行检索分析，发现对照狐猴共有58010 个序列，冬眠狐猴共有35957个序列与数据库中的成熟miRNA一致。此外，共发现狐猴骨骼肌中存在234个保守的成熟miRNAs。
在已鉴定的234个成熟miRNAs中，20个miRNAs(约占保守miRNAs的9%)在对照组和冬眠组狐猴骨骼肌之间有差异表达。在冬眠期间，11个miRNA显著上调，9个miRNA显著下调。FDR校正P值后，发现只有4个miRNAs的p值小于0.05，分别是miR-2478、miR-1386、miR-4792和miR-8503。由于冬眠组狐猴miRNA表达谱的高度个体差异，使用阈值为0.01的原始p值进行下游多变量分析。通过绘制log10转换的p值与log2转换的倍数变化，利用火山图可视化了差异miRNA的表达。其中上调的miRNAs有：miR-1260b, miR-4792, miR-7550, 和miR-6236，下调的 miRNAs 有：miR-1a/b, miR-133和miR-30a。完整的miRNA DE分析结果可在补充表2中进行查看。高通量测序发现3个丰度最高的miRNA，分别是miR-30a、miR-1260b和miR-95（图1）。
图1：差异化表达分析
无监督层次聚类分析将表达水平相近的miRNA分组在一起。分析还显示了高、中、低丰度的miRNA转录组，其中大多数miRNA都聚集在低丰度的一支中，即树状图左边。除了Control 3和Torpor 2之外，所有样品都可按实验条件进行分组。第1组有: Torpor1、Torpor3, Torpor4和Control3，第2组有: Control1、Control2、Control4和 Torpor2。进行PCA主成分分析，发现PC1分离的样本几乎都可以归因与对照和冬眠状态。
图2：无监督聚类分析
30个差异表达的miRNA的Pearson相关性分析发现在对照样品中显著正相关的miRNA-对包括：miR-2779和miR-7550、miR-133和miR-1c，和miR-4792和miR-889。在冬眠样本中，显著相关的miRNA配对包括许多在对照中识别的配对以及可以查看的新的配对呈现在图3B中。对照样品聚集成明显不同的正相关群体，例如miR-133d、miR-133c、miR-133a、miR-133、miR-1260b、miR-1a/b和miR-1c。相反，冬眠样本中并没有显示出许多不同的集群。完全Pearson相关系数可以在补充表3中进行查看。
图3: 21个差异表达miRNAs的监督Pearson相关聚类分析的热图
通过RT-qPCR技术验证了以下六个miRNAs的水平：miR-7280、miR-2478、miR-1386、miR-1260b、miR-133、miR-1。其中miR-7280、miR-2478、miR-1386和mR-1260 b在用这两种方法检测时，都被发现明显地上调。同样，miR-133和miR-1的下调也遵循了RNA-seq分析中观察到的相同趋势，其中miR-133下调明显，然而miR-1下调并不明显。通过分析发现RNA-seq DE和RT-qPCR的结果是一致的，这表明前者的结果是正确的（图1A和图4）。
图4：RT-qPCR验证一些显著差异表达的miRNA的相对丰度
miRNA的预测图结果：对所有差异表达的miRNAs进行mRNA相互作用分析，所有结果均呈现在补充表4中。例如，miR-1a-1-5p被发现可能存在201个不同的mRNA靶点。对GO注释和KEGG路径被评估为了GS分析。在比较冬眠动物和对照动物时，骨骼肌中富集了15个GO生物过程，包括基因表达的正调控和负调控、RNA聚合酶II启动子和pre-miRNA加工过程转录的正调控。这些生物过程的分布、数量和变化方向如图5B所示。在冬眠的过程中，16个GO分子功能被富集，包括调控区核酸结合、核酸结合转录因子活性和RNA聚合酶II转录因子活性序列特异性DNA结合（图5C）。GO注释编号列于补充表5和6中。在冬眠期间，KEGG途径富集发现15个过度表达的信号通路（图5A）。重要富集的KEGG通路(氧化磷酸化、mTOR、MAPK和ERBB)通过miRNA影响评分可视化直观显示在相关基因上（图6）。完整GS分析的结果可以在补充表5-7中查看。
图5：基于Logistic回归的基因集富集的火山图
图6：在冬眠期间缺乏miRNA抑制的关键KEGG通路的图形显示
20个差异表达的miRNAs用于RF-FS分析。首先选择以下16个miRNAs ：miR-5280, miR-4792, miR-889, miR133c, miR-6301, miR-133d, miR-30a, miR-6236, miR-1260b, miR-1a/b, miR-133, miR-1c, miR-2478, miR-7280和miR-1386。随后进行了类似SFS的选择步骤，但袋外错误率的增加趋势表明，第一组16个miRNAs是最重要的区分靶点。
图7：基于随机森林(RF)的特征选择结果
图8：MS TN、ME F2C、MYOG、SP1和UCP2的相对mRNA丰度水平检测
从文献中选择所检测的mRNA靶点，因为它们在miR-133的上游调节因子和下游靶点方面已经得到了广泛的探究。miR-133的上游负调控因子MSTN的转录水平相比对照组，在冬眠期间显著升高了1.80±0.21倍。和对照组相比，miR-133的上游正调控因子MEF2C在冬眠期间保持不变。与对照组相比，2个miR-133的下游mRNA靶点（SP1和UCP2）在冬眠期间显著升高，分别增加了1.92±0.26倍和1.56±0.11倍。然而，下游的MYOG水平并未发生变化（图8）。
讨论
灰鼠狐猴进化出各种分子适应能力，使机体代谢率降低，从而在寒冷和食物匮乏期间促进冬眠。肌肉维持和新陈代谢的精准机制是必要的，以保持功能和克服由于在冬眠过程中长期不动而产生的伤害。本研究使用小RNA测序和综合的生物信息学策略来解答狐猴如何调节冬眠唤醒周期的难题。
Control 3和Torpor2除外，在实验条件下对对照动物和冬眠动物miRNA表达谱的进行无监督分层聚类。实验条件下样品的分离表明，所识别的变化是对冬眠的响应。在所鉴定的234个保守miRNAs中，20个在冬眠期间差异表达，其中11个上调，9个下调。在研究这些对冬眠反应敏感的miRNAs的功能性作用之前，研究者进一步利用随机森林特征选择来分析这些miRNAs，以选择表达与冬眠条件相关的miRNAs的最小子集。这导致了16个miRNAs的鉴定，它们的表达水平可以区分对照状态和冬眠状态，并可能作为冬眠的可测量生物标志。
在鉴定的冬眠下调的miRNA中，miR-30的减少已被证明了能够限制成肌细胞的分化和发育。因此，在冬眠期间，狐猴可能下调miRNA，以限制ATP消耗大的的肌肉生长和分化。此外，miR-1和miR-133的表达在冬眠期间也被下调。miR-1和miR-133在肌肉细胞增殖、分化、发育、维持和功能过程中都被激活。例如，miR-1已经被证明可以调节肌肉转录因子MEF2A和GATA4的表达，而两者都可以促进肌肉的维持。
研究者之前对小冬眠动物miR-1和miR-133的研究与目前的狐猴研究结果并不完全一致：在冬眠的蝙蝠和有袋动物的肌肉中，miR-1和miR-133都显著上调，而地鼠只显示miR-133下调。最近，miR-1和miR-133在冬眠的瑞典棕熊体内都被发现上调，这是一种类似狐猴的“温暖冬眠”。在其他自然生长型动物模型中，在冷冻和耐缺氧的普通美洲斑潜鱼的脚部肌肉中也有上调，其应激存活也随之进入非营养状态。在这些调节系统中，miR-1和miR-133的增强表达被认为是通过影响肌源性维持因子来促进肌肉损伤修复和萎缩抵抗。在狐猴中，miR-1和miR-133的下调表明，在冬眠期间经历的不活动期，存在着防止肌肉废用的替代机制。狐猴和其他冬眠动物miR-1和miR-133表达的差异可能源于狐猴对每天短的冬眠状态的依赖，而不是长时间的不活动。这种每天短暂的冬眠状态的本质可能使得对能量消耗巨大的肌肉过程进行广泛的重塑成为不必要，这可能是因为冬眠狐猴面临的主要挑战不是肌肉废用性萎缩。事实上，据报道miR-1和miR-133针对狐猴的其他潜在关键过程的研究，如细胞凋亡，发现miR-1和/或miR-133的减少有利于生存。值得注意的是，一项关于功能超负荷肌肉的研究发现miR-1和miR-133水平降低，提示它们参与了肌肉肥大，然而对于狐猴来说，同时考虑到之前所报道的预测蛋白质合成速率在冬眠期间降低的情况，发生肥大是不可能的。为了探讨miR-133可能的功能，研究者研究了选择的上游调控因子MSTN和MEF2C的表达水平以及下游mRNA靶点。MSTN是miR-133的负性调节因子，其转录水平在冬眠期显著上调，这与miR-133的下调和先前报道的唤醒期肌抑制素的升高是一致的。肌肉抑制素水平的增加可能通过限制骨骼肌的大小和在严格的能量供应期间将能量偏好转换为脂肪酸消耗来减少肌肉能量消耗。可能作为一种准备机制，来促进颤抖和随后的觉醒。相反，MEF2C（一种诱导miR-133的转录因子）的mRNA水平在冬眠期间保持不变。可能需要持续的MEF2C来调节骨骼肌发育、纤维类型的控制和葡萄糖代谢，所有这些对于成功的冬眠都是必需的。应该注意的是，MEF2C蛋白经历了广泛的翻译后修饰后允许它们作为转录激活物或抑制物发挥作用。因此，缺乏MEF2C转录水平的下调并不一定表明活性磷酸化MEF2C蛋白下调。miR-133下调的另一个可能机制，是通过先前报道的在冬眠狐猴肌肉中p38MAPK水平的升高，其中p38MAPK已经被证明可以减少miR-133和miR-1的表达。
研究者还检测了几个miR-133下游靶点（SP1、UCP2和MYOG）的转录水平。SP1和UCP2在冬眠期间均上调，这与miR-133下调一致，因为这些基因面临的miR-133抑制较少。SP1通过介导细胞周期蛋白D1的转录促进细胞周期阻滞，从而通过生长抑制在冬眠期间促进能量储存。相比之下，UCP2水平的提高可能在狐猴在冬眠期间经历的热量限制所需的代谢适应中起作用。UCP2在预防活性氧（ROS）产生和调节[ATP]：[ADP]比值方面也起着一定的作用。UCP2的结果进一步支持了先前骨骼肌能量在冬眠期间储存的研究。至于MYOG，尽管miR-133直接抑制其表达，但miR-133下调与MYOG上调并不一致，而MYOG在冬眠期间则保持不变。总之，MEF2C和MYOG的稳定水平，加上MSTN、SP1和UCP2的上调提示，在能量受限的冬眠状态下，狐猴可能利用miRNAs介导能量限制，而不是进行广泛的肌肉重塑和活跃的成肌细胞促进。
当研究者将讨论的焦点放在冬眠期间下调的miRNAs上时，发现11个功能特征不明显的miRNAs在冬眠狐猴中上调。大多数miRNAs被发现能抑制细胞生长，从而在冬眠期间保护有限的细胞资源。以miR-2478为例，miR-2478已被证明能抑制TGFβ1蛋白，该蛋白主要负责细胞增殖和分化。同样，miR-889在冬眠期间的上调也可能通过靶向TGF-β激活激酶1和MAP3K7结合蛋白1（TAB1）而抑制细胞增殖，这是TGF-β和MAPKs与成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）之间存在一定的联系。miR-4792的上调已经被证明可直接作用于FOXC1，它可以抑制细胞增殖并引发细胞周期停滞。
全部的miRNA变化的功能影响揭示了对照组和冬眠组之间丰富的GO节点和KEGG途径。GO和KEGG分析都发现，大多数富集途径在冬眠期间缺乏miRNA抑制，这代表了一个大范围的多功能靶点。缺乏miRNA抑制的大多数靶向KEGG途径可被归类为“肌肉启动”途径。其中一个途径是MAPK信号级联，这是冬眠（越冬）和每日冬眠适应性反应中的一个保守的成分。目前的研究表明，miRNA抑制的缺乏可能是导致MAPK激活的原因，这一点以前在冬眠的狐猴肌肉中已有相关的报道。事实上，MAPK通路似乎在狐猴冬眠期间受到多层次的调节。例如，特定的MAPK酶在冬眠狐猴骨骼肌中上调，包括ERK1/2、JNK、p38MAPK；而磷酸化的MEK（S217/221）和ERK1/2（T202/Y204、T185/Y187）的表达水平则下调。当这些活化的磷酸化蛋白水平再次降低时，表明细胞生长和增殖在冬眠的骨骼肌中被抑制。
其他在冬眠期间富集的缺乏miRNA抑制的途径包括黏着斑信号通路、ErbB和mTOR/Akt信号通路。黏着斑信号通路是一个支持骨骼肌完整性结构和功能维持的过程。ErbB信号用于维持骨骼肌组织。至于mTOR/Akt，由于miR-1和miR-133直接靶向mTOR/Akt通路，因此两种miRNA水平的降低都支持其能够被激活。然而，虽然mTOR/Akt参与了肌原纤维蛋白的蛋白质合成和翻译效率的提高，但这些过程在冬眠的骨骼肌中不太可能被显著激活。其他的关于冬眠的研究表明mTOR被抑制，因为营养缺乏和低心肌细胞能量状态强烈抑制mTOR的水平，表明在冬眠期间的细胞处于能量受限的状态。mTOR调节的另一个方面是，mTOR在一定程度上被骨骼肌机械应激的增加所激活，这是狐猴在冬眠期间不活跃时不曾经历的增加情况。值得注意的是，在冬眠的南美有袋类动物小山猴Dromiciops gliroides的骨骼肌中也观察到了黏着斑信号通路、ErbB信号和mTOR信号的调节。暗示这种保守的反应可能是成功的冬眠唤醒循环的必要条件。利用这些途径以及它们之间可能发生的相互作用，可能是冬眠动物在不活动期间用来调节骨骼肌的一种策略。
氧化磷酸化被认为为在冬眠骨骼肌中显著抑制miRNA，这对新陈代谢来说是有意义的，因为狐猴在每天的冬眠期间退缩来减少能量的消耗。线粒体呼吸、电子传递和氧化磷酸化的减少已知在冬眠期间发生。这种冬眠导致的线粒体呼吸作用也在另外两种冬眠的马达加斯加狐猴（克氏鼠狐猴和肥尾鼠狐猴）的白色脂肪组织的RNA-Seq研究中得到发现。
另外两个代谢途径被预测为显著抑制miRNA是酪氨酸和组氨酸代谢途径。氨基酸保护是预防肌肉萎缩和维持肌肉质量的已知策略，这些初步的研究结果，再加上预测缺乏活跃的肌肉重塑，表明了在冬眠期间肌肉保护的一种状态。这与冬眠中狐猴的RNA-Seq研究结果相矛盾，后者显示冬眠白色脂肪组织中的氨基酸代谢增加，强调了饥饿条件下每个组织的不同代谢需求。此外，miRNA似乎显著地抑制了核糖体机制，这可能有助于在冬眠过程中所需的能量保存策略，并进一步支持狐猴肌肉在冬眠过程中不经历重要的蛋白质合成过程的假设。
预测的缺少miRNA抑制的GO分子的功能包括转录因子结合和活性、调控序列特异性DNA结合和激酶活性。miRNA对这些功能的抑制作用的缺乏表明它们需要在冬眠期间调节转录网络。至于富集GO节点的生物过程，大多数显著富集的节点在冬眠期间受到的miRNA抑制似乎较少。这类功能包括基因表达的正调控和负调控、RNA聚合酶II启动子的转录和pre-miRNA的加工过程。对这些过程的调节表明了促进冬眠所需的调节网络的对立平衡，这些功能似乎协同工作，促进对KEGG信号转导途径的冬眠反应性调节，这些途径被认为缺乏miRNA介导的抑制作用。KEGG和GO富集节点的相似性表明，GO生物学节点被miRNAs抑制，包括线粒体呼吸链复合体的组装、核糖体的生物合成和rRNA新陈代谢过程。
结论
研究者利用小RNA测序分析鉴定了20个对冬眠反应敏感的狐猴骨骼肌miRNAs的一个子集。结果表明差异表达的冬眠miRNAs似乎参与了代谢率降低所需的节能过程。当所有的miRNA发生变化，关键的miR-1和miR-133的下调似乎是维持日常冬眠所需的策略性肌肉质量的核心。从而对比了它们在其他深度冬眠中的作用，它们可以促进广泛的、ATP消耗巨大的肌肉再生和重塑过程，以对抗肌肉废用性萎缩。
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