科研 | Angew. Chem. Int. Ed.：化学蛋白质组学De Novo光控荧光蛋白羧酸酯酶抑制剂光控药物代谢的新发现
编译：北越城主，编辑：Tracy、江舜尧。
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在本篇文章中，我们首次报道芳基偶氮吡唑脲和砜作为一类新型的丝氨酸水解酶抑制剂光开关，同时推出了一种化学蛋白质组学平台，用于快速发现复杂蛋白质组中的光控丝氨酸水解酶靶标。我们确定了药物代谢酶羧酯酶1和2的高效选择性光开关抑制剂，并通过光学控制免疫抑制剂霉酚酸酯的代谢来证明化合物的药理学作用。总之，这项概念的验证研究提供了第一个通过调节代谢酶活性来光学控制药物代谢的光药理学技术案例。我们的芳基偶氮吡唑脲和砜提供了可合成获得的支架，可以对芳基偶氮吡唑脲和砜进行扩展以鉴定其他丝氨酸水解酶（包括脂肪酶，肽酶和蛋白酶）的特定光开关抑制剂。我们的化学蛋白质组学平台也可以扩展到其他光开关和支架实现对各种蛋白质类别的光学控制。
论文ID
实验设计
实验结果
受到我们先前对三唑脲作为活性位点丝氨酸导向的共价丝氨酸水解酶抑制剂的研究的启发，本实验中，我们试图通过芳基吡唑光开关取代三唑离开基团来设计具有光控功能的丝氨酸水解酶抑制剂。我们选择芳基偶氮吡唑作为光控转换的部分是因为它具有出色的光化学特性，例如Z异构体的定量转换和高热稳定性（图1）。我们通过三个合成步骤合成了六种具有不同头基的芳基偶氮吡唑脲抑制剂，并且收率很高。为了合成抑制剂，首先，我们使用硝酸钠和盐酸将苯胺1转化为重氮盐，然后我们将其加入2,4-戊二酮和乙酸钠的悬浮液中，通过烯醇盐加成得到腙2，腙2再与肼一水合物在乙醇中回流后，得到芳基偶氮吡唑3。然后我们通过在碱性条件下使相应的氨基甲酰氯与芳基偶氮吡唑3反应来生成芳基偶氮吡唑脲4-9。
接下来，我们继续确定所得脲的光化学性质，并将其与原始的芳基偶氮吡唑光敏开关进行比较。首先，我们使用UV-Vis光谱法确定了最佳的E-Z异构化波长，由于与吡唑相连的羰基的π-受体性质，我们的脲化合物4-9的π-π*λmax值（E-异构体为308-312 nm）与原始N-甲基芳基偶氮吡唑（335 nm；图2A）相比略微蓝移。我们观察到E和Z异构体在365 nm处的吸光度存在显着差异，从而确保了该波长下的高EZ转化率，而脲4在室温下仅用紫外线照射（365 nm）五分钟后，就具有95％Z异构体的光固定态（PSS）表现出出色的转化率（图2B），同样，所有其他芳基偶氮吡唑脲在紫外线照射后均表现出大于94％的E-Z转化率。此外，我们通过NMR光谱在37℃下随时间测量了Z芳基偶氮吡唑脲向E的热弛豫，确定了4-9的预期长半衰期（图2C，2D）。
图2 芳基偶氮吡唑脲抑制剂的光异构化性质
我们获得并分析了E-和Z-4的晶体结构。如预期所示，芳基偶氮吡唑脲4在E-Z转化时经历了明显的构象转换，将二面角从6.1°更改为34.6°（ϕNNhet），将二面角从25.6°更改为41.5°（ϕpheNN，图2E）。由此我们推测，E-和Z-脲构象有着如此显着的差异可能导致两种异构体对给定靶标丝氨酸水解酶的亲和力之间存在明显的差异。
接下来，我们使用基于凝胶的竞争性蛋白质组分析方法，鉴定了复杂蛋白质组中尿素4-9的E和Z异构体潜在丝氨酸水解酶靶标。我们试图以我们的化合物的E-异构体作为竞争剂，确定其在是否365 nm光处理下情况下，对丝氨酸水解酶特异性活性的差异。实验中，我们首先将人大肠腺癌Caco-2细胞溶解产物在37℃下用100 nM所示E-异构体进行有无紫外线照射5分钟，然后用我们最近发表的丝氨酸水解酶定向ABPP探针处理10（图3A）在rt放置1小时，接下来我们使用铜（I）催化的叠氮炔环加成（CuAAC）将TMR荧光染料安装在10个分子上，通过SDS-PAGE分离探针标记的蛋白，并使用凝胶内荧光扫描显像所得的荧光带，最终，我们观察到大约位于60 kDa的单个条带消失，其中4-6的E-异构体显示出最大的竞争。我们使用30 nM抑制剂进行了进一步评估，结果表明E-4和E-5完全竞争了该谱带（图3A），而紫外线照射的E-异构体则没有明显的竞争，且凝胶上的其他丝氨酸水解酶条带似乎也没有与我们的化合物竞争。
为了鉴定60 kDa丝氨酸水解酶，我们再次使用探针10在Caco-2裂解物中进行了基于竞争性质谱的实验。我们将裂解液在37℃下用E4或DMSO处理1小时，然后用10 μM探针10处理，然后进行链霉亲和素富集，消化和基于MS的分析。我们的数据分析表明，两个目标，即大小约60 kDa的酶，羧酸酯酶1（CES1）和2（CES2）完全竞争，比率分别为0.04和0。该实验中没有其他丝氨酸水解酶参与竞争，从而证实了E-4的优异特异性。
羧基酯酶是来自α/β折叠水解酶家族的丝氨酸酯酶。因为它们通过水解异生物素的酯键和酰胺键参与I期代谢，所以羧酸酯酶可以激活或失活各种疗法，并极大地影响代谢药物的药代动力学和药效学，因此，人们主要将CES酶作为控制含酯药物代谢以优化其药理特性的药物靶标。由于大多数羧酸酯酶以及其他水解丝氨酸水解酶的药物都在肝脏中表达，我们在肝癌细胞系Hep G2中进行了另一项竞争性MS实验，这次是同时使用E-4或E-5。E-4再次与CES1（比率0.35）和CES2（比率0.06）竞争，而E-5与CES1（比率0.25）竞争（图3B），此外未检测到其他36种丝氨酸水解酶。
具有氟膦酸酯探针的竞争性ABPP只能揭示丝氨酸水解酶作为潜在靶标，因此，为了排除尿素酶4和5也可能靶向其他类型蛋白质的可能性，我们用炔烃手柄取代烯丙基臂，合成了源自抑制剂5的炔烃探针14。我们用炔丙基溴处理烯丙胺11，得到仲胺12，然后在碱性条件下用羰基二咪唑将其活化，得到咪唑脲13。最后，与芳基偶氮唑3偶合，得到探针14。
然后，我们对来自不同组的13种细胞系的裂解物进行了基于凝胶的标记实验，并获得了不同的蛋白质表达谱。我们发现，用100 nM探针14进行处理后仅在Hep G2中标记了两条谱带，在Caco-2裂解物中标记了一条谱带（图4A），而在任何其他细胞系中均未标记出谱带。通过从Hep G2裂解物中富集14种并进行MS鉴定，我们再次确认这些蛋白质为CES1和CES2。为了进一步的验证，我们用探针14在HEK 293T细胞裂解物中标记了过表达的CES1和CES2（图4B），在活的Hep G2细胞中标记了天然CES1和CES2。对于后一个实验，我们将活Hep G2细胞用14处理4小时，然后进行细胞裂解，使用TMR染料的CuAAC和凝胶内荧光可视化。以上这些实验清楚地表明了我们的芳基偶氮唑脲对CES1和CES2出色的选择性，与以前发现的选择性有限或未报告的CES抑制剂不同，我们的芳基偶氮吡唑脲化合物在存在其他丝氨酸水解酶的情况下会选择性抑制CES1/2。
图4 基于探针14 CES1/2选择性活性的评价
由于CES的高特异性和共价结合，探针14也可用于CES酶的荧光成像（图4C）。首先我们将Caco-2细胞进行CES1 siRNA敲低或非靶向对照48小时，然后再将细胞重新接种在盖玻片上，并用14（100 nM）或DMSO处理4小时，然后进行甲醇固定，缀合至TMR染料，通过CuAAC反应和荧光显微镜成像，我们观察到部分CES1 siRNA敲除不成比例地消除了用14处理后的荧光信号；同时，荧光凝胶结果显示14处理的CES1敲除细胞裂解液中也有类似程度的标记减少（图4C和4D）。综上所述，这些结果证实14可用作天然CES1的特定成像试剂。
CES1是人类羧酸酯酶家族中研究最好的外源性酯水解酶，例如，CES1负责激活许多前药如血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂，奥司他韦等。因此，我们进一步关注了CES1，并使用探针14进行了基于凝胶的竞争实验，评估和量化了尿素4和5的E-和齐莫异构体对CES1的不同抑制活性。参照图5，随后我们用探针14处理，定量CES1带荧光信号，并计算IC 50值（图5A-D）。E-4和E-5具有相似的IC50值（分别为13和11 nM；图5B和5D）。我们发现4的E-和辐射E异构体的IC50值相差7.4倍，而5的异构体则相差5.7倍。因此，我们决定继续使用抑制剂4。此外，我们还对活的Hep G2细胞进行了异构化实验，我们用E-4处理细胞，然后在4℃的黑暗中放置或在4℃的365 nm光下照射5分钟，然后在37℃孵育4小时。细胞溶解后，我们又使用14处理，通过CuAAC反应与TMR叠氮化物缀合，最终使用内凝胶荧光扫描观察结果。结果显示，原位处理/异构化也显示E-4和辐照的E-4的IC50值相差5.1倍（分别为5.0 nM和25.4 nM）。我们的抑制剂显示出的IC50值差异比未报道的其他生物活性可光转换抑制剂的相似度更高。
具有可逆光转换的CES抑制剂将被允许在活动状态和非活动状态之间重复循环，这种情况对于某些基础研究应用（例如药代动力学参数计算）可能是比较理想的。我们假设用结构相似但亲电性较低的过渡态模拟物（如磺酰基）取代共价抑制剂4中的羰基，可能会产生非共价CES抑制剂。为了合成抑制剂4的砜类似物，我们将氨磺酰氯15在碱性条件下与芳基偶氮吡唑3偶联，得到基于砜的芳基偶氮吡唑16。与芳基偶氮吡唑脲相比，16的紫外-可见光谱显示λmax略有红移至329 nm（图6A）。芳基吡唑砜16可以分别通过365 nm和525 nm的光照射进行E和Z异构体之间切换，1 H-NMR也分析显示PSS从E-到Z-亚型的转化率为87％。此外，芳基偶氮吡唑砜16具有优秀的热稳定性，通过1H-NMR分析（在37℃下随时间推移Z-到E-16的转化），t1/2为105小时（图6B和6C）；16也表现出很高的光稳定性，因为其异构化可以在Z和E异构体之间循环至少8次，而没有明显的分解（图6D和6E）。进一步，我们还进行了一系列光异构化实验，以确定我们的化合物在水性缓冲液中能够保持稳定并可靠地进行切换。为此，我们确定了热弛豫半衰期，测量了PBS中化合物Z-4，Z-5，Z-14和Z16的ZE光异构化，评估了14和16在10 mM谷胱甘肽的PBS中稳定性和切换可靠性。结果如图6所示，我们的结果证实了以前的观察芳基偶氮唑光开关与水性缓冲液的相容性。
我们首先通过探针14基于凝胶的竞争测定法测试了16是否仍与CES1结合。可视化共价结合探针与潜在的非共价抑制剂的竞争需要仔细优化时间，温度和探针浓度，因为不可逆的反向交换与酶结合的可逆抑制剂和不可逆探针之间的距离必须最小化，可逆抑制剂将仅在有限的时间段内竞争给定酶的不可逆探针标记，而这种竞争情况具体取决于抑制剂亲和力和探针反应性。Hep G2裂解物在37℃下用E-16处理1小时，然后在冰上静置5分钟，最后添加14至终浓度30 nM。我们将样品在冰上孵育15分钟，然后偶联至TMR叠氮化物，并如上所述通过凝胶内荧光观察。在这些条件下，我们观察到E-16（37 μM）和受辐照的E-16（112 μM；图7A和7B）的IC50值相差3倍。为了进一步证实16个可逆结合CES1，我们进行了凝胶过滤实验，然后进行了基于凝胶的ABPP：将Hep G2裂解物与16个在37℃孵育1小时，然后对一部分混合物进行葡聚糖凝胶过滤去除非共价结合的抑制剂，然后使用Bradford分析法将过滤后的和未过滤样品的蛋白质浓度标准化，最后用探针14（30 nM）进行处理。我们观察到未经过滤的砜16对CES1标记的竞争，过滤几乎完全恢复了CES1标记（图7C）。相反，尿素4的过滤并未导致CES1标记的恢复（图7C），这些结果表明了16个可逆结合和4个共价结合。虽然之前已经报道过基于砜的丝氨酸水解酶抑制剂，但用亲电性较弱的砜取代羰基，并从共价支架中设计可逆抑制剂，成为了一种发现丝氨酸水解酶可逆抑制剂简单新颖的方法。
图7 芳基偶氮吡唑脲16可逆结合CES1
然后，我们着手评估16对与其他丝氨酸水解酶结合的选择性。我们使用各种基于广泛活性的探针优化标记条件，以观察CES1的最佳竞争。因此，我们最近报道的基于对硝基苯基膦酸酯活性的探针17（30 nM）提供了Hep G2裂解物中16与CES1结合的最佳可视化效果。在相同条件下，我们进行了一项MS实验，以鉴定在Hep G2裂解物中被砜16竞争的蛋白质，由于抑制剂16具有可逆性，因此我们再次以低浓度（30 nM）使用探针17，最终在该实验中仅检测到适量的12种丝氨酸水解酶。实际上，在80 μM的E-16上，，只有CES1和CES2相对于DMSO对照的比率低于0.5（图7D）。因此，基于凝胶和质谱的竞争性蛋白质组学实验，我们得出的结论是，我们的砜16保留了对CES1和CES2的显着特异性。
由于CES1在许多含酯药物的代谢中发挥重要作用，使用我们的抑制剂对CES1活性进行控制将为这些药物在复杂蛋白质组(如细胞和组织裂解液)中的代谢和药代动力学提供有价值的信息。我们采用基于质谱的分析方法来测量CES催化的含酯前药霉酚酸酯Mofetil 18（MMF）到霉酚酸19（MPA）和2-吗啉代酮-1-醇的CES催化水解（图8A）。MMF是CES1的已知底物，也是一种免疫抑制剂，广泛用于预防器官移植排斥反应和克罗恩氏病；MMF中的吗啉代乙酯掩盖了极性羧酸酯基团，以增加药物的亲脂性。不考虑是否伴随光异构化，我们用econfiginhibitor 4处理原生Caco-2裂解液，在37℃下处理1小时，然后加入MMF(30 μM)，在指定的时间，用乙酸乙酯萃取，并通过LC-MS对剩余的MMF进行定量。如预期所示，30 nM E-4未辐射E-4抑制了CES1介导的18水解（图8B），而E-4将MMF的半衰期从43分钟增加到79分钟（图8B）。M4在经辐射的E4处理裂解物中的半衰期与在DMSO处理的样品中获得的值几乎相同。相对于辐照的E-16，我们用可逆砜抑制剂E-16进行的处理也导致MMF的半衰期延长了2.1倍（Δt1/ 2 = 29分钟；图8C）。此外，在我们的基因控制实验中，siRNA介导的CES1敲低也使半衰期增加了一倍，从而精确概括了用E-4和E-16获得的结果。最后，我们探索了通过可逆抑制剂16的重复光异构化对裂解物中MMF水解进行可逆光学控制的可能性。我们在存在大量非限制性过量MMF（150μM）的情况下，用E16处理了Caco-2裂解物，并对其进行了辐照，样品重复进行两次完整的异构化（图8D）。实际上，E-和Z-同工型之间的光开关赋予了MMF水解速率显着变化，这与我们上面显示的实验数据一致。这些实验共同表明，我们的可光转换抑制剂可以通过对关键代谢酶CES1的光学控制来暂时控制药物如霉酚酸酯的半衰期和代谢。
图8 CES1介导的药物水解的光学控制
结论
总之，我们已经开发出芳基偶氮吡唑脲和砜作为一类新型的光开关丝氨酸水解酶抑制剂，并建立了一种化学旋转平台，可以快速筛选我们的抑制剂以发现复杂细胞裂解物中的光学控制丝氨酸水解酶靶标。我们确定了两种高效且具有选择性的光转换抑制剂，包括药物代谢酶羧酸酯酶1（CES1）和2（CES2），并通过光学控制细胞溶解物中免疫抑制剂药物霉酚酸酯的代谢来证明这些光转换抑制剂的实用性。据我们所知，这是第一个通过药物代谢酶的活性调节来证明对药物代谢的光学控制研究。最后，我们的化学旋转平台可以扩展到其他支架和光开关，以实现对其他蛋白质类别的光学控制，这些研究目前正在进行中。