RNA干扰基因表达实验技术原理

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种利用小RNA发夹结构来抑制基因表达的有效方法，在生物医学研究中取得了重大进展，特别是在通过干扰基因功能来解析基因型-表型关系方面。由于基于RNAi的工具和技术的激增，以及RNAi在需要瞬时基因敲除的特殊应用中的独特优势，RNAi仍然是现代生物学家的一个重要研究工具。

尽管CRISPR/Cas9介导的基因编辑等新技术的发展，可能会使RNAi在特定应用中的效用黯然失色，但这项重要的技术仍然被广泛使用，具有高度的适用性。RNAi是一种双链RNA介导的机制，在转录后水平调控基因表达，其工作原理是将双链RNA发夹结构加工成小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)或微RNA (microRNA/miRNA)。然后，这些小RNA与同源的mRNA结合，并通过RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)诱导其降解。

miRNA的形成和调控机制
  MicroRNA（miRNA）是一类长度为19-23nt的小型非编码RNA，对植物和动物的基因表达具有调节作用，最先在秀丽隐杆线虫中被发现，随后被证明在人类等高等脊椎动物的基因组中编码，以序列特异性方式作用于靶mRNA，以促进其切割、降解或降低其翻译效率。

miRNA的初级产物是pri-miRNA，它是一种至少包含一个发夹结构的长RNA转录本，在细胞核内核糖核酸酶RNase III（即Drosha和DGCR8/Pasha）的作用下，生成前体miRNA（pre-miRNA）。随后，pre-miRNA在Exportin-5复合物的作用下被转运出细胞核，在细胞质中由Dicer酶剪切成为成熟的miRNA。成熟的miRNAs可通过Argonaute蛋白质家族与RISC结合，从而导致靶mRNA降解或翻译抑制（图1描述了miRNA的形成和调控机制）。

siRNA的形成和调控机制
  Small interfering RNA（siRNA）是一种小的外源性dsRNA，包含约20个核苷酸，在体外RNA干扰（RNAi）过程中人工合成或通过转运体从细胞核转移到细胞质中。在秀丽隐杆线虫中，dsRNA通过跨膜蛋白SID-1被转移到细胞质中，再经DCR-1处理形成双链siRNA。这些双链siRNA与RISC结合形成小干扰RISC（small interfering RISC, siRISC），然后通过解旋酶作用激活siRISC。随后，激活的siRISC以序列特异性的方式作用于靶mRNA，导致互补靶mRNA降解，从而抑制翻译过程（图1描述了siRNA的形成和调控机制）。

miRNA和siRNA之间既有相似之处，比如长度均约为20个核苷酸，都由dsRNA产生，由Dicer酶切割参与RNAi过程。但二者也有许多不同之处，比如miRNA是单链小RNA，通过抑制翻译而不是影响转录稳定性来调节基因表达，而siRNA是双链小RNA，通过在转录后水平上降解靶mRNA来调节基因表达等。