病毒包装原理及步骤
采用第3代重组慢病毒包装系统制备病毒颗粒。为了增加慢病毒的安全性能,病毒制备所必需的元件序列被拆分到4个质粒当中,分别是:
1)1个编码目的基因的慢病毒转移质粒。目的基因两侧各有一个LTR(long terminal repeat)序列,LTR序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。为了提高安全性能,转移质粒的3’ LTR缺失了部分序列,使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。
2)2个包装质粒。其中一个质粒编码Rev, 另外一个质粒编码Gag和Pol。
3)1个编码包膜蛋白的质粒。
利用上述质粒包装出来的重组慢病毒颗粒,被称为自我失活VSV-G假型慢病毒(self-inactivating VSV-G pseudotyped lentivirus)。
每次包装重组慢病毒,包装质粒和编码包膜蛋白的质粒都是固定不变的,变的是编码目的基因的转移质粒。
首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜的培养基后,继续培养48~72小时。收集培养液,进行离心浓缩后,就可得到转导细胞级别的病毒颗粒。如果您想获得注射动物级别的超纯病毒颗粒,可以利用蔗糖超速离心进一步去除杂质,从而获得纯度更高的病毒颗粒。
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