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A TP53-associated gene signature for prediction of prognosis and therapeutic responses in lung squamous cell carcinoma
TP53相关基因在预测肺鳞癌预后和疗效中的作用
发表期刊：Oncoimmunology
发表日期：2020 Mar 2
影响因子：5.869
DOI: 10.1080/2162402X.2020.1731943
肺癌是人类常见的恶性肿瘤之一，是全世界癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）有三种不同的亚型：（1）肺腺癌（LUAD）；（2）肺鳞状细胞癌（LUSC）；（3）大细胞肺癌（LCLC）。LUSC约占所有肺癌病例的30%，在全球范围内，每年导致约40万人死亡。
肿瘤蛋白p53(TP53)位于染色体17p13.1上，编码肿瘤抑制蛋白p53.7是人类最常见的突变基因，50%以上的人类癌症都表明p53信号的改变。功能上，p53直接与染色质结合，在调节细胞周期、细胞凋亡、自噬和DNA修复等对损伤性物质的反应中发挥重要作用。TP53突变，主要是错义突变，也是NSCLC中最常见的突变，在LUSC中比LUAD中更常见。
1）TCGA：来自LUSC和LUAD患者的基于VarScan 2的体细胞突变数据，结合基因表达数据和相应的临床特征
2）Data Coordinating Center：LUSC基因表达、临床和体细胞突变数据
3）ICGC：下载体细胞突变数据，以估计LUSC患者的体细胞突变
1）差异表达基因（DEGs）筛选：R包'edgeR'，获取TCGA LUSC队列中具有（n = 388）和不具有（n = 100）TP53突变的患者之间的DEG
2）基因集富集分析（GSEA）：R包'clusterProfiler '
3）识别TP53相关的预后特征：R包'survival '进行单变量Cox回归分析、多变量Cox回归分析确定特定基因标志的预后价值、生存分析
4）免疫细胞估计：CIBERSORT、R包'Genefilter '用于筛选每个样品
5）免疫治疗和化学治疗反应预测：使用肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）算法和亚类图谱来预测免疫检查点抑制剂的临床反应；使用R包 'pRRophetic '来估计GDSC网站上每个LUSC患者的半最大抑制浓度（IC50）确定的化疗反应
6）估计肿瘤突变负担（TMB）
7）基因相关的预后特征与其他临床特征的独立性：单变量和多变量Cox回归分析、nomograms图
8）免疫组化实验
01 - LUSC和LUAD的突变
作者试图鉴定LUSC和LUAD患者的体细胞突变。根据TCGA数据，TP53突变是最常见的，在LUSC中比LUAD更普遍（77% vs. 47%；图1）。还在ICGA数据库中发现了LUSC突变，一致的是，TP53也是最频繁突变的基因（排名第二），这与其在TCGA数据库中的高频率一致。
图1 LUSC和LUAD样本中的突变
02 - 鉴别有TP53突变和没有TP53突变的LUSC患者之间的DEGs
TP53突变率高，表明TP53状态与LUSC密切相关。作者将LUSC患者分为TP53突变组和野生型组，并探讨它们之间的DEGs。总共确定了773个上调基因和783个下调基因（图2a,b）。为了深入了解DEG的功能，基于GSEA分析进行了基因本体（GO）富集分析。TP53突变状态基因在与免疫功能相关的术语中富集度最高，表明TP53突变状态相关基因主要可能在LUSC的免疫相关过程中发挥了重要作用。
图2 鉴定伴有或不伴有TP53突变的LUSC患者的DEGs
03 - 构建基于DEG的预后特征
为了确定与LUSC患者总体生存相关的DEGs，进行了单变量Cox回归分析。在p＜0.05时，确定75个基因对LUSC患者的总体生存率有预后作用。然后应用多变量Cox回归分析来考察基因与总体生存的相互关系，只有3个基因显示出显著的LUSC预后信号，包含KLK6、MUC22和CSN1S1（图3a）。计算出预测预后值的风险评分，将LUSC患者分为低危组或高危组（图3b-d）。Kaplan-Meier分析表明，高危患者的总生存期明显差于低危患者（图3e）。
图3 构建基于DEG的预后特征
04 - 根据TP53突变状态对总生存期进行Kaplan-Meier分析
与三基因签名的预后能力一致，TP53突变状态与LUSC患者的预后也显著相关（图4a）。为了研究三基因签名是否独立于TP53突变状态，根据TP53突变状态将LUSC患者分为高危组和低危组。基于三基因特征的两组Kaplan-Meier总体生存曲线在TP53 WT和TP53 MUT LUSC队列中存在显著差异（图4b,c）。
作者还发现TP53突变类型会影响LUSC患者的预后（图4d）。为了探究三基因特征是否独立于TP53突变类型，对包含TP53错义突变的最大亚组进行了预后分析。有趣的是，三基因签名起到了负面作用，这些基因的高表达缩短了LUSC患者的总体生存期（图4e）。
图4 根据TP53突变状态进行总生存率的Kaplan-Meier分析
05 - LUSC高低危患者的免疫细胞浸润图谱
接下来研究了LUSC高危和低危患者之间免疫浸润的差异。如图5a,b所示，22种肿瘤免疫细胞类型的比例在LUSC高危和低危患者之间有显著差异。此外，免疫细胞比例呈弱至中度相关（图5c）。LUSC高危患者的单核细胞和巨噬细胞M1比例明显较高，而T细胞CD8和T细胞滤泡辅助细胞比例较低。
图5 LUSC高危和低危患者的免疫细胞浸润景观
还根据TGCA体细胞突变数据计算了TMB评分。LUSC患者的TMB明显更高。在LUSC中观察到的免疫浸润的异质性可能为免疫治疗提供预后指标和靶点，可能具有重要的临床意义。
06 - LUSC高危和低危患者的免疫治疗和化疗反应
作者估计了免疫检查点阻断（靶向CTLA-4和PD-1的高风险和低风险LUSC患者）的临床反应。高风险的LUSC患者对抗PD-1治疗的反应更有希望（图6a）。还调查了LUSC高危和低危患者对化疗的反应，发现29种化疗药物在LUSC高危和低危患者之间的估计IC50表现出显著差异，LUSC高危患者对所有29种化疗药物的敏感性均有增加（图6b）。
图6 高危和低危LUSC患者的免疫治疗和化疗反应
07 - 三基因特征与临床特征的相关性
接下来，研究了三基因签名衍生的风险评分是否是一个独立的生物标志物。单变量Cox回归分析表明，TNM期、T期和风险评分与LUSC患者的生存率较差相关，多变量Cox回归分析表明，TNM期、T期和风险评分仍与LUSC患者的生存率较差相关。
风险评分可作为LUSC的特定预后指标（图7a,b）。根据多变量分析中的因素建立了预后nomograms图。与TNM期和T期相比，风险评分显示出优越的预测性能（图7c）。
图7 三基因特征与临床特征的相关性
08 - 基因签名在临床组织样本中的验证情况
为了证实所确定的基因签名的可靠性，利用含有90对LUSC组织和相邻正常组织的组织芯片，通过免疫组化检测KLK6和CSN1S1的表达水平。结果显示，KLK6和CSN1S1蛋白与正常组织中的蛋白相比，在肿瘤组织中显著过表达（图8a,b）。
此外，为了确定KLK6和CSN1S1是否可以作为LUSC患者的预后生物标志物，进行了生存分析，结果显示KLK6和CSN1S1的表达水平与LUSC患者的总生存期至关重要（图8c）。还评估了基因签名（KLK6和CSN1S1）的表达与PD-L1的相关性，发现KLK6和CSN1S1与PD-L1的表达显著相关（图8d）。
图8 在临床组织样本中验证基因特征
总体而言，本研究首次发现了一个与TP53突变状态相关的三个基因签名，可以独立预测LUSC患者的生存状况。高危的LUSC患者可能会从免疫治疗和化疗中获得更大的获益，使用该签名可能会对这些患者的临床治疗产生重大影响。
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