MPB：中南大学刘学端、马丽媛组-基于16S测序和RT-qPCR的硫化矿物表面微生物群落组成分析

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注：其中c（ng/μL）为浓度；MW=碱基数目（bp）× 660（Daltons/bp）表1. RT-qPCR扩增 Acidithiobacillus菌属的特异性引物信息*Target speciesPrimer namePrimer sequences (5’-3’)Amplicon length (bp)Acidithiobacillus ferrooxidansrus-Srus-AACAAGGGATTCGGTCATAGTTTCCGTCGGATGCCAGGTAAA153Acidithiobacillus caldussoxX1-SsoxX1-ACAGTATTCCACCCATCAACGACTCCACCTGGCAAGACAT114AcidithiobacillusthiooxidansSqr-SSqr-AGCTCGGCAGCCTCAATACGGTCGGACGGTGGTTACTG136AcidithiobacillusferrivoransCspA-SCspA-ATCCTCAGCCTGCATGCCTTGGTACAGTAAAGTGGTTCA180* Ma 等, 2017a; Ma 等, 2017b; Ma 等, 2018; Tao 等, 2018; Wang 等, 20202）RT-qPCR反应a.基于Bio-rad iCycler iQ实时定量PCR监测系统，采用四个优势种的特异性引物进行RT-qPCR扩增。反应体系（25 µl）包括：2×SYBR Green核酸染料，12.5 µl；上下游引物，各0.5 µl；双蒸水，6.5 µl；cDNA模板，5 µl。反应条件为：95 °C，5 min；40个循环内（95 °C，30 s；55-59 °C，30 s；72 °C，30 s）；95 °C，1 min；55 °C，10 s（其中55-59 °C为不同引物的特异退火温度）；80个循环内（自59 °C每个循环增加0.5 °C，至99 °C，每个循环10 s）；4 °C延伸，反应终止。每个样品设置三个技术重复，同时每板设置三个阴性对照。结果与分析1.通过1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop-1000微量分光光度计检测矿物表面微生物DNA提取质量，并利用双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒在Qubit 2.0核酸蛋白定量仪上测定DNA浓度。2.16S rRNA基因测序技术为微生物群落的组成及多样性研究提供了强有力的工具，能够识别已知和未知物种，但通常只能鉴定至属水平（Lukhele 等, 2019）。据报道，酸性矿山环境物种多样性相对较低，代表性优势类群约占微生物总量的90%，如既能氧化亚铁又能氧化硫的嗜酸硫杆菌属（Acidithiobacillus）和硫化杆菌属（Sulfobacillus），仅能氧化亚铁的钩端螺旋菌属（Leptospirillum）和铁质菌属（Ferroplasma）。其中，Acidithiobacillus是广泛存在于AMD环境的典型类群，该属中嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）和耐冷嗜酸硫杆菌（A. ferrivorans）能够氧化亚铁和硫获取能量，而嗜酸氧化硫硫杆菌（A. thiooxidans）和嗜酸性喜温硫杆菌（A. caldus）仅能够通过氧化矿物中的硫获得能量维持自身代谢（Chen 等, 2015; Méndez-Garcíaet 等, 2015）。RT-qPCR虽无法挖掘未知物种信息，但能够对已知物种进行精确定量。表2. 铁硫富集群落在黄铜矿浸出过程中优势属相对丰度GenusFe-OS-ODay 12Day 18Day 24Day 12Day 18Day 24Acidithiobacillus99.48%96.01%64.91%81.76%82.73%76.36%Leptospirillum0.02%0.23%23.85%0.004%0.36%16.48%Sulfobacillus0.06%3.39%8.43%18.04%16.77%11.31%Sphingomonas0.05%0.04%0.00%0.02%0.003%0.00%Streptophyta0.03%0.005%0.01%0.02%0.01%0.01%3.在分别利用富铁少硫能源底物和富硫少铁能源底物驯化菌群（分别命名为Fe-O和S-O）进行黄铜矿浸出实验中，16S rRNA高通量测序结果表明，在各组中Acidithiobacillus均为绝对优势属（＞60%），在Fe-O群落浸出初期占比甚至高达99%（表2），但铁氧化菌或硫氧化菌在群落中的占比并不清楚。基于RT-qPCR精确定量结果，获得A. ferrooxidans、A. ferrivorans、A. thiooxidans和A. caldus的扩增比例，带入16S rRNA测序结果中Acidithiobacillus的相对丰度，计算属内四个优势种在整个样本中的相对量，并将微生物群落组成以柱形图展示。如图1所示，Acidithiobacillus属内不同铁硫氧化功能类群的相对丰度得以明确，在铁富集浸出体系中，A. ferrooxidans和A. caldus为优势种，分别占30%-45%和30%-65%；而A. thiooxidans和A. ferrooxidans在硫富集浸出体系中占据主导地位，相对丰度分别约为50%和20%。因此，在16S rRNA测序的基础上，联合RT-qPCR技术精确定量Acidithiobacillus属的不同功能类群，能够更加全面揭示浸出过程中群落组成及演替规律，为冶金微生物的浸出行为及机理研究奠定基础。（Ma 等, 2018; Tao 等, 2018）。

图1. 铁硫富集群落在黄铜矿浸出过程中群落演替规律溶液配方1.9K培养基(NH4)2SO43 gK2HPO40.5 gKCl0.1 gCa(NO3)20.01 gMgSO4·7H2O0.5 g溶于1 L蒸馏水中2.琼脂糖凝胶（1%）琼脂糖               1 gTBE缓冲液（0.5x）   100 ml致谢本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目（资助号：31570113和42007306）和中南大学生物冶金教育部重点实验室基金（资助号：MOEKLB1702）的支持。参考文献1.Chen, L. X., Hu, M., Huang, L. N., Hua, Z. S., Kuang, J. L., Li, S. J. and Shu, W. S. (2015). Comparative metagenomic and metatranscriptomic analyses of microbial communities in acid mine drainage. ISME J 9(7): 1579-1592.2.Lukhele, T., Selvarajan, R., Nyoni, H., Mamba, B. B. and Msagati, T. A. M. (2019). Diversity and functional profile of bacterial communities at Lancaster acid mine drainage dam, South Africa as revealed by 16S rRNA gene high-throughput sequencing analysis. Extremophiles 23(6): 719-734.3.Ma, L., Wang, X., Feng, X., Liang, Y., Xiao, Y., Hao, X., Yin, H., Liu, H. and Liu, X. (2017a). Co-culture microorganisms with different initial proportions reveal the mechanism of chalcopyrite bioleaching coupling with microbial community succession. Bioresour Technol 223: 121-130.4.Ma, L., Wang, X., Tao, J., Feng, X., Zou, K., Xiao, Y., Liang, Y., Yin, H. and Liu, X. (2017b). Bioleaching of the mixed oxide-sulfide copper ore by artificial indigenous and exogenous microbial community. Hydrometallurgy 169: 41-46.5.Ma, L., Wang, X., Liu, X., Wang, S. and Wang, H. (2018). Intensified bioleaching of chalcopyrite by communities with enriched ferrous or sulfur oxidizers. Bioresour Technol 268: 415-423.6.Méndez-García, C., Peláez, A. I., Mesa, V., Sánchez, J., Golyshina, O. V. and Ferrer, M. (2015). Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats. Front Microbiol 6: 475.7.Tao, J., Qin, C., Feng, X., Ma, L., Liu, X., Yin, H., Liang, Y., Liu, H., Huang, C., Zhang, Z., Xiao, N. and Meng, D. (2018). Traits of exogenous species and indigenous community contribute to the species colonization and community succession. Front Microbiol 9: 3087.8.Wang, X., Ma, L., Wu, J., Xiao, Y., Tao, J. and Liu, X. (2020). Effective bioleaching of low-grade copper ores: Insights from microbial cross experiments. Bioresour Technol 308: 123273.