原创：我的冻干笔记（2）
本帖最后由 蒲公英 于 2016-4-23 22:55 编辑
本文是蒲公英小一班微信群一位朋友，学习了《真空冷冻干燥技术》，自己做的笔记，与大家共享：
我对冷冻干燥技术的原理、冻干机组成、冻干参数、冷冻干燥的程序、影响冷冻干燥过程的因素、冻干制品不合格现象和解决方法的学习心得。
第三节 冻干参数
水的存在形式和水的冻结
水是构成生命的重要物质，水在生物系统中有多种存在形式。一种叫做自由水以溶液或悬浮液形式存在，这种水冷冻的时能结冰；另一种以氢键方式结合在一些极性基团上，包含在极性基团形成的网状结构之中，这部分水即使在极低的温度下也不会结冰，叫做结合水；另外生物系统中还有至今仍未搞清楚的其他形式存在的水。
水的结冰过程是这样的：当水的温度降到冰点0℃时，如果缺乏晶核，水并不结冰，温度继续下降，水还是保持在液体状态，这叫做水的过冷现象；当水中存在一些外来物质时，外来物质便成为水结冰的晶核，于是水分子以晶核为核心，并以一定的排列方式结合成固态的晶格结构。一旦结冰开始之后温度会从过冷温度迅速上升到0℃（结冰时的放热所引起），在结冰过程中保持0℃不变，只有全部水都结成冰之后，温度才继续下降。冰晶的数量和大小受二个因素的影响；即成核速率和晶体生长速率的影响，接近0℃时晶核的生长速率增加而成核速率很低，因此在0℃保持一段时间将产生数量少而尺寸大的晶体；越过0℃，在较低
的温度下冻结时将得到数量多而尺寸小的晶体。
结晶的基本原理
结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相的过程。这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定的晶格中，这种有规律的排列与表面分子化学键力的变化有关，因此结晶过程也是一个表面化学反应的过程。
当溶液的浓度等于溶质的溶解度时，该溶液称为饱和溶液，溶质的浓度超过溶解度时的溶液则称为过饱和溶液，溶质只有在过饱和溶液中才有可能析出。众所周知，溶解度与温度有关，一般物质的溶解度随温度升高而增大，也有少数例外，如红霉素的溶解度反而随温度的升高而降低。溶解度与温度的关系，可以用饱和曲线和过饱和曲线来表示。
图中S—S线为饱和溶解度曲线，在此曲线以下的区域为不饱和区，称
为稳定区。T—T 线为过饱和溶解度曲线，在此曲线以上的区域称为不稳定区。而介于S—S线和T—T 线之间的区域称为亚稳区。
在稳定区内的任一点溶液都是稳定的，不管采用什么措施都不会有结晶析出。在亚稳区内的任一点，如不采取措施，溶液也可以长时间保持稳定，若加入晶种，溶质就会在晶种上长大，溶液的浓度随之下降到S—S线。亚稳区中各部分的稳定性并不一样，接近!—! 线的区域较稳定，而接近S—S线的区域极易受刺激而结晶。因此有人提出将亚稳区再一分为二，上半部为刺激结晶区，下半部为养晶区。
在不稳区内的任一点溶液都能立即自发结晶，在温度不变时溶液浓度会自动降至S—S线。因此，溶液需要在亚稳区或不稳区才能结晶。在不稳区结晶生成很快，来不及长大，浓度即降至溶解度，易形成大量细小的晶体，这是工业结晶不希望的。为了得到颗粒较大而又整齐的晶体，通常需加入晶种并把溶液浓度控制在亚稳区的养晶区内，让晶体缓慢长大，因为在养晶区内自发产生晶核的可能性很小。
晶体的产量取决于固体物质与溶液之间的平衡关系。若溶液未达到饱和，则固体溶解。如果溶液饱和，则固体与饱和溶液处于平衡状态，其溶解速度等于沉淀速度。只有当溶液浓度超过饱和浓度达到过饱和时，才有可能析出结晶，因此过饱和度是结晶过程的推动力和首要条件。
结晶过程的步骤
结晶是从均一的溶液中析出固相晶体的过程，通常包含三个步骤：即过饱和溶液的形成，晶核的生成与晶体的成长。
1、过饱和溶液的形成
结晶的首要条件是溶液要过饱和，制备过饱和溶液的方法一般有以下（4）种。
（1）冷却结晶这是最简便而常用的结晶方法，使溶液冷却降温成为过饱和溶液而析出结晶。例如制霉菌素的浓缩液，将其在5℃条件下冷却4-6h，即能结晶完全。析出晶体。此法一般适用于溶解度随温度的降低而显著下降的物质。
（2）蒸发结晶在常压或减压下加热蒸发，除去部分溶剂，使溶液达到过饱和而析出结晶。为了避免产物在高温下易破坏，生物药物一般多采用减压蒸发。例如赤霉素的乙酸乙醋提取液在减压下浓缩，除去溶剂后即有结晶析出。
（3）盐析结晶在溶液中添加某些物质，从而使溶质在溶剂中的溶解度降低而析出。
加入的物质既可以是固体，也可以是液体。常用的有氯化钠、硫酸铵等盐类和甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。例如在巴龙霉素硫酸盐的浓缩液中加10-12倍体积的质量分数为95%的乙醇，即可得硫酸巴龙霉素的结晶。
（4）化学反应结晶调节溶液的pH值或加入反应剂，生成溶解度更小的新物质，使其浓度超过它的溶解度而析出结晶。氨基酸等一些两性化合物，常利用它们在等电点时溶解度最小的原理，只需调节溶液的pH值就可获得结晶。如6.氨基青霉烷酸（(6.APA）的钠盐水溶液，用盐酸调节至pH为3.8-4.1（等电点附近）时，即可从水溶液中结晶出来。许多抗生素也常利用加入某些成盐剂（反应剂），使生成难溶性盐或复盐的形式从溶液中析出结晶。
上述方法在工业生产上可单独使用，也可结合起来使用，以强化过饱和度而获得较多的结晶。
2.晶核的生成
晶核的形成是一个新相产生的过程，需要消耗一定的能量。在溶液中分子的能量或速度具有统计分布的性质，在过饱和溶液中也是如此。当能量在某一瞬间、某一区域由于布朗运动暂时达到较高值时会析出微小的颗粒，即结晶中心称为晶核。晶核不断生成并继续成长为晶体。一般自动成核的机会较少，常需借助外来因素促进生成晶核，如机械振动、搅拌等。
晶核生成的速率与过饱和度及温度有关，在一定温度下成核速率随过饱和度的增加而加快，但当超过某一值时，反而会使溶液的分子运动减慢，黏度增加，成核也受到阻碍。在过饱和度不变的情况下，温度升高，成核速率也会加快。但温度对过饱和度也有影响，一般当温度升高时，过饱和度降低，所以温度对成核速率的影响要以温度和过饱和度的相互消长程度来决定。实际情况是成核速率开始随温度升高而升高，达最大值后，温度继续升高，成核速率反而降低。在工业生产上，结晶过程要求有适当的成核速率，成核速率过快，必将导致生成细小的晶体，影响产品质量。
3.晶体的成长
在饱和溶液中，晶核一经形成，立即开始长成晶体，同时还在不断生成新的晶核，因此，所得到晶体的大小，决定于晶核生成速率与晶体成长速率两者的对比关系。若晶体成长速率大大超过晶核生成速率，过饱和度主要用来使晶体成长，则可得到粗大而有规则的晶体；反之过饱和度主要用来生成新的晶核，则所得到的晶体颗粒参差不齐，晶体细小，甚至呈无定形。在工业生产中，通常都希望得到颗粒粗大而均匀的晶体，可以使后续的过滤、洗涤和干燥操作比较方便，同时产品质量也可提高。
影响晶体大小的因素主要有溶液的过饱和度、温度、搅拌速率等。一般来说过饱和度增加，所得晶体较细。温度的影响比较复杂，当溶液快速冷却时，达到过饱和度较高，所得晶体也较细，而缓慢冷却常得到粗大颗粒。搅拌能促使成核和加速扩散，提高晶核成长的速率，但超过一定范围后，效果就不显著。相反搅拌越快，晶体越细。若要获得比较粗大和均匀的晶体，一般温度不宜太低，搅拌不宜太快，并要控制好晶核生成速率，应小于晶体成长速率。最好将溶液控制在亚稳区内结晶，使其在较长的时间内，只有一定量的晶核生成，而使原有的晶核不断成长为晶体。
此外，加入晶种也能控制晶体的形状、大小和均匀度。但首先晶种应有一定的形状、大小和比较均匀。加入晶种还可降低溶液的过饱和度，诱导结晶，提前生成晶核。所以在工业生产中如遇结晶液浓度较低而结晶发生困难时，可加入适量晶种，促使结晶顺利地进行。多糖、蛋白质、酶和核酸等生物高分子物质，由于相对分子质量大，结构复杂，不易定向聚集，比一般小分子物质较难形成结晶，常需加晶种诱导，且所需的时间和能量也较多。
重结晶
重结晶就是将晶体用合适的溶剂溶解后再次进行结晶，以提高纯度。虽然从理论上说通过结晶可以得到纯的产物，但实际上，通过一次结晶得到的产品总含有一些杂质。这是因为一些溶解度与产品相近的杂质，也会部分地结晶下来。有些杂质还会被结合到产品结晶的晶格中去，或因洗涤不完全，不能除去结晶中夹杂的母液，使晶体沾染了杂质。因此需要重结晶来进一步提高产品的纯度。
重结晶的关键是选择合适的溶剂。用于重结晶的溶剂一般应具备下列条件：
1.对需重结晶的产物有一定的溶解度，但不宜过大，当外界条件改变时其溶解度明显减少；
2.对色素、降解产物等杂质有较好的溶解度；
3.无毒或低毒，沸点低便于回收套用。
常用于重结晶的溶剂有蒸馏水、丙酮、甲醇、乙醇等低级醇、石油醚、乙酸乙酯等。若该产物结晶易溶于某一种溶剂而难溶于另一种溶剂，且该两种溶剂能互溶，则可以用两者的混合溶剂来进行重结晶。重结晶的操作方法是将该产物先溶于溶解度较大的溶剂中，然后缓慢加入第二种溶剂直至稍呈浑浊，即结晶刚开始时为止，冷却放置一段时间，使结晶完全。
例如将维生素B12粗品结晶溶解于少量蒸馏水中，滤去不溶杂质，然后加入水溶液体积8-10倍的丙酮至呈现混浊为止，冷却静置两天，可得纯度较高的产品。
结晶和重结晶都是制备纯物质的有效方法。通常只有同类分子或离子才能有规律地排列成晶体，所以结晶过程有很好的选择性。通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，再经过滤、洗涤等就可得到纯度高的晶体。
溶液的冻结
溶液的冰点和沸点与溶媒和溶质都不同，它随溶质的浓度不同而有不同的冰点和沸点。以水溶液为例来说明溶液的凝结过程。水溶液的凝结与纯水不一样，它不是在某一固定温度下完全凝结成固体，溶液温度降低到某一温度对，晶体开始析出，随着温度的降低，晶体的数量不断增加，最后溶液全部凝结。因此溶液是在某一温度范围内凝结的，冷却时开始析出晶体的温度称溶液的冰点，而溶液全部凝结的温度叫溶液的凝固点，是溶质和溶媒全部结晶的温度点。在溶液的结晶过程中溶液的浓度会增加，冰点会下降，稀溶液变为浓溶液，并逐步成为饱和溶液，温度继续降低时，由于溶解度降低，将会有溶质的晶体析出，最后成为冰晶体和溶质晶体的共晶混合物，这时的温度就是溶液的共晶点温度。这个过程也是一个放热过程，在冷冻曲线上也会像水结冰那样出现过冷和一个平台。
产品的冷冻参数：过冷度、共晶点温度、产品冻结温度、结晶度。
过冷度:
过冷度是指低于冰开始形成时的冷冻平衡温度的度数。水保持过冷状态冷冻含有不同成分的配方可以形成冰晶体。在过冷条件下，高冰的生长速率和过冷度的平方成正比。高过冷度会提高冰晶体的生长速率而形成非常小的冰晶。
产品冻结温度:冷冻产品到比崩解温度低10℃的温度；冻结温度下水的移动性小于0.5。
结晶度D:配方冷冻时结冰的量。
结晶度是指产品中形成的冰的量和等量水形成的冰的量的比率。当产品中冰的量与产品中可冻结水的总量比值接近0.5时，得到的产品块不会有海绵状外观并且对通过产品块的水蒸气气流阻碍作用增大。
共晶点
共晶点的基本定义：冷冻过程中，该温度下溶液的自由度为零。饱和溶液的溶解曲线和溶剂结冰点凹陷的交点。
需要冻干的产品，一般是预先配制成水的溶液或悬浊液，因此它的冰点与水就不相同了，水在0℃时结冰，溶液的冰点将低于溶媒的冰点。另外，溶液的结冰过程与纯液体也不一样，纯液体如水在0℃时结冰，水的温度并不下降，直到全部水结冰之后温度才下降，这说明纯液体有一个固定的结冰点。而溶液却不一样，它不是在某一固定温度完全凝结成固体，而是在某一温度时，晶体开始析出，随着温度的下降，晶体的数量不断增加，直到最后，溶液才全部凝结。这样，溶液并不是在某一固定温度时凝结。而是在某一温度范围内凝结。当冷却时开始析出晶体的温度称为溶液的冰点。而溶液全部凝结的温度叫做溶液的凝固点。凝固点就是融化的开始点（即熔点），对于溶液来说也就是溶质和溶媒共同熔化的点。所以又叫做共熔点或共晶点。可见溶液的冰点与共熔点是不相同的。共熔点才是溶液真正全部凝成固体的温度。
显然共熔点的概念对于冷冻干燥是重要的。因为冻干产品可能有盐类、糖类、明胶、蛋白质、血球、组织、病毒、细菌等等的物质。因此它是一个复杂的液体，它的冻结过程肯定也是一个复杂的过程，与溶液相似，也有一个真正全部凝结成固体的温度，即共熔点。由于冷冻干燥是在真空状态下进行的。只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华干燥，否则有部分液体存在时，在真空下不仅会迅速蒸发，造成液体的浓缩，产品的体积缩小；而且溶解在水中的气体在真空下会迅速蒸发出来，造成像液体沸腾的样子，冻干产品鼓泡、甚至冒出瓶外。这是我们所不希望的。为此冻干产品在升华开始时必须要制冷产品温度到共熔点以下的温度使产品真正全部冻结。
在冻结过程中，从外表的观察来确定产品是否完全冻结成固体是不可能的；靠测量温度也无法确定产品内部的结构状态。而随着产品结构发生变化时电性能的变化是极为有用的，特别是在冻结时电阻率的测量能使我们知道冻结是在进行还是已经完成了，全部冻结后电阻率将非常大，因此溶液是离子导电。冻结时离子将固定不能运动，因此电阻率明显增大。而有少量液体存在时电阻率将显著下降。因此测量产品的电阻率将能确定产品的共熔点。
产品的共熔点可以通过电阻法、示差热分析法（DTA）、示差扫描热量法（DSC）和低温显微镜直接观察法得知。其中电阻检测法方便宜行，目前应用最多，可以自制测定装置，直接获取数据。
正规的共熔点测量法是将一对白金电极浸入液体产品之中，并在产品中插一支温度计，把它们冷却到-40℃以下的低温，然后将冻结产品慢慢升温。用“惠斯顿”电桥来测量其电阻，当发生电阻突然降低时，这时的温度即为产品的共熔点。电桥要用交流电供电，因为直流电会发生电解作用，整个过程由仪表记录。
也可用简单的方法来测量，用二根适当粗细而又互相绝缘的铜丝插入盛放产品的容器中，作为电极。在铜电极附近插入一支温度计，插入深度与电极差不多，把它们一起放入冻干箱内的观察窗孔附近，并用适当方法把它们固定好，然后与其他产品一起预冻，这时我们用万用表不断地测量在降温过程中的电阻数值，根据电阻数值的变化来确定共熔点。
共熔点是在预冻阶段和升华阶段需要进行控制的温度值。
冻干升华参数：共溶点温度、玻璃化转变温度、崩解温度。
玻璃化转变温度：
当液体温度降低时，液态转变为固态，有两种不同状态：晶态和非晶态。在非晶态固体材料中，原子、离子或分子的排列是无规则的。因为人们已习惯将融化物质在冷却过程中不发生结晶的无机物质称为玻璃，所以后来逐渐地将其他非晶态均称为玻璃态。由于在药品冻干中要求更加严格，希望药品在冻干的过程中处于玻璃化温度以下。但这里玻璃化转变温度不是指完全的玻璃化，因为完全的玻璃化是指整个样品都形成了玻璃态，实现完全玻璃化要求极高的降温速率，几乎是不可能的。冻干的过程中玻璃化温度指最大冻结浓缩液的玻璃化转变温度。因为在冻结过程中随着冰晶的析出，剩余溶液的浓度逐渐增加，当达到一定浓度时，剩余的水分不继续结晶，此时的溶液达到最大冻结浓缩状态，对应的温度称为最大冻结浓缩液的玻璃化转变温度。
塌陷（崩解）温度
塌陷温度是指溶质间区域的水的流动性为零时温度。一个正常升华的产品，当升华进行到一定的时候，就会出现上部的已干层和下部的冻结层，这二层之间的交界面就是升华面，随着升华的进行而不断下降的。
已经干燥的产品应该是疏松多孔，并保持在这一稳定的状态，以便下层冻结产品升华出来的水蒸汽能顺利地通过，使全部产品都得到良好的干燥。但某些已经干燥的产品当温度升高到某一数值时，会失去刚性，变得有粘性，发生类似塌方的崩解现象，使干燥产品失去疏松多孔的状态，封闭了下层冻结产品水蒸汽的逸出通路，妨碍了升华的继续进行。于是，升华速率变慢，从冻结产品吸收升华热也随之减少，板层供给的热量将有多余，这样便引起冻结产品的温度上升，当温度升高到共熔点以上的温度时，产品就会发生熔化或发泡现象，致使冻干失败。
发生崩解时的温度叫做该产品的崩解温度。对于这样的产品要获得良好的干燥，只有保持升华中的干燥产品的温度在崩解点以下，直到冻结产品全部升华完毕为止，才能使产品温度继续上升。这时由于产品中已不存在冻结冰，干燥产品即使发生崩解也不会影响产品的干燥而会影响产品的活性，因为产品已从升华阶段转入解吸干燥阶段。没有发生崩解的干燥产品与发生崩解的干燥产品在外观上用肉眼看不出有什么差别，只有在显微镜下才能看到结构上的变化。当在显微镜下观察产品的冷冻干燥过程时，如果看到发生崩解现象，那么这时的温度就是该产品的崩解温度。
有些产品的崩解温度高于共熔点温度，那么升华时仅需控制产品温度低于共熔点就行了；但有些产品的崩解温度低于共熔点温度，那么按照一般的方法控制升华时就可能发生崩解现象，这样的产品只有在较低的温度下进行升华，因此必须延长冻干时间。
产品的共熔点可以通过电阻法、示差热分析法（DTA）、示差扫描量热法（DSC）和低温显微镜直接观察法得知，但产品的崩解温度只有在冷冻干燥显微镜下直接观察才能得知。产品的崩解温度取决于产品本身的品种和保护剂的种类；混合物质的崩解温度取决于各组分的崩解温度。因此在选择产品的冻干保护剂时，应选择具有较高崩解温度的材料，使升华干燥能在不很低的温度下进行，以节省冻干的能耗和时间，提高生产率。