HNSCC数据分析-GSE6631-HG_U95Av2-GPL8300 / 四六文摘

五月份的学徒专注于GEO数据库里面的表达量芯片数据处理，主要的难点是表达量矩阵获取和探针的基因名字转换，合理的分组后就是标准的差异分析，富集分析。主要是参考我八年前的笔记：

下面是sophie的投稿

数据集介绍

GEO链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE6631
芯片平台：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL8300 [HG_U95Av2] Affymetrix Human Genome U95 Version 2 Array

样品列表：

GSM153813 Normal mucosa 1 GSM153814 Cancer 1 GSM153815 Normal mucosa 2 GSM153816 Cancer 2 GSM153817 Normal mucosa 3 GSM153818 Cancer 3 GSM153819 Normal mucosa 4 ...

文章链接是：Selection and validation of differentially expressed genes in head and neck cancer. Cell Mol Life Sci 2004 Jun;61(11):1372-83. PMID: 15170515 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15170515

核心步骤

R包加载

rm(list = ls()) library(AnnoProbe) library(GEOquery) library(ggplot2) library(ggstatsplot) library(reshape2) library(patchwork)

获取并且检查表达量矩阵

主要是得是否需要log

# 获取表达量矩阵 gse_number <- 'GSE6631' gset <- geoChina(gse_number) a=gset[[1]] dat=exprs(a) dim(dat) gpl_number = a@annotation

# 检查，判断需不需要取log dat[1:4,1:4] dat = log2(dat) boxplot(dat[,1:4],las=2) library(limma) dat=normalizeBetweenArrays(dat) dat[1:4,1:4] # 画图，使用ggplot需宽数据变长数据 class(dat) data <- as.data.frame(dat) data <- melt(data) head(data) title <- paste (gse_number, "/", gpl_number, sep ="") p1 <- ggplot(data,aes(x=variable,y=value))+ geom_boxplot()+ theme_ggstatsplot()+ theme(panel.grid = element_blank(), axis.text=element_text(size=10,face = 'bold'), axis.text.x=element_text(angle=90), plot.title = element_text(hjust = 0.5,size =15))+ xlab('')+ ylab('')+ ggtitle(title) p1> dat[1:4,1:4] GSM153813 GSM153814 GSM153815 GSM153816 1000_at 8.882447 9.080824 9.004535 8.681835 1001_at 6.815514 6.420102 6.472333 6.402285 1002_f_at 5.381824 5.200093 5.700040 5.723010 1003_s_at 7.219051 7.129450 7.361891 7.504878

可以看到，处理前后我们的表达量矩阵的表达量范围箱线图如下所示：

根据生物学背景及研究目的人为分组

library(stringr) pd=pData(a) group_list=ifelse(grepl('Normal',pd$title),'control','HNSCC') group_list = factor(group_list,levels = c('control','HNSCC'));table(group_list)

为了演示方便，我们这里仅仅是区分"HNSCC"和“control”。

probe_id 和symbol的转换至表达矩阵

获取芯片注释信息

代码如下：

ids = idmap("GPL8300") dim(ids)

可以看到此芯片的探针与基因ID或者symbol的对应关系如下所示：

> head(ids) probe_id symbol 553408 1000_at MAPK3 553409 1001_at TIE1 553410 1002_f_at CYP2C19 553411 1003_s_at CXCR5 553412 1004_at CXCR5 553413 1005_at DUSP1

探针基因ID对应以及去冗余

代码如下：

library(tidyr) library(dplyr) library(stringr) #接下来，使探针与基因symbol一一对应 ids=as.data.frame(ids) table(rownames(dat) %in% ids$probe_id) dat=dat[rownames(dat) %in% ids$probe_id,] ids=ids[match(rownames(dat),ids$probe_id),] ids$probe_id=as.character(ids$probe_id) rownames(dat)=ids$probe_id ids=ids[ids$probe_id %in% rownames(dat),] dat=dat[ids$probe_id,]

#下一步是：基因symbol去冗余-按照表达量最大值筛选 ids$median=apply(dat,1,median) #ids新建median这一列，列名为median，同时对dat这个矩阵按行操作，取每一行的中位数，将结果给到median这一列的每一行 ids=ids[order(ids$symbol,ids$median,decreasing = T),] #对ids$symbol按照ids$median中位数从大到小排列的顺序排序，将对应的行赋值为一个新的ids ids=ids[!duplicated(ids$symbol),]#将symbol这一列取取出重复项，'!'为否，即取出不重复的项，去除重复的gene ，保留每个基因最大表达量结果s #获得去冗余之后的dat/exp dat=dat[ids$probe_id,] #新的ids取出probe_id这一列，将dat按照取出的这一列中的每一行组成一个新的dat #把ids的symbol这一列中的每一行给dat作为dat的行名 rownames(dat)=ids$symbol table(group_list)

最后得到了表达量矩阵如下所示：

> dat[1:4,1:4] #保留每个基因ID第一次出现的信息 GSM153813 GSM153814 GSM153815 GSM153816 ZZZ3 6.194570 6.398336 5.749128 6.469465 ZZEF1 5.952447 5.816752 5.864333 5.925680 ZYX 10.959871 10.586963 10.338066 10.142952 ZWINT 5.722146 6.759732 6.574198 7.398797

以及最简单的2分组，如下所示：

>table(group_list) group_list control HNSCC 22 22

保存为R数据文件：step1-output.Rdata

save(dat,ids,group_list,gse_number,title,file = "step1-output.Rdata")

标准步骤之质控

得到标准的3张图，包括主成分分析，高变基因的表达量热图，样品相关性热图

## 下面是画PCA的必须操作，需要看说明书。 exp <- dat exp=t(exp)#画PCA图时要求是行名时样本名，列名时探针名，因此此时需要转换 exp=as.data.frame(exp)#将matrix转换为data.frame library("FactoMineR")#画主成分分析图需要加载这两个包 library("factoextra") dat.pca <- PCA(exp , graph = FALSE)#现在exp最后一列是group_list，需要重新赋值给一个dat.pca,这个矩阵是不含有分组信息的


# 画图，主成分分析图p2

this_title <- paste0(gse_number,'_PCA')

p2 <- fviz_pca_ind(dat.pca,

geom.ind = "point", # show points only (nbut not "text")

col.ind = group_list, # color by groups

palette = "Dark2",

addEllipses = TRUE, # Concentration ellipses

legend.title = "Groups")+

ggtitle(this_title)+

theme_ggstatsplot()+

theme(plot.title = element_text(size=15,hjust = 0.5))
p2
# 下面是1000_sd热图

library(pheatmap)

cg=names(tail(sort(apply(dat,1,sd)),1000))#apply按行（'1'是按行取，'2'是按列取）取每一行的方差，从小到大排序，取最大的1000个

n=t(scale(t(dat[cg,])))

n[n>2]=2

n[n< -2]= -2

n[1:4,1:4]

ac=data.frame(Group=group_list)

rownames(ac)=colnames(n)

# 画图，高变基因的表达量热图p3

p3 <- pheatmap::pheatmap(n,

show_colnames =F,

show_rownames = F,

main = gse_number,

annotation_col=ac,

breaks = seq(-3,3,length.out = 100))#因为已经手动设置了表达量最大值，所以，可以不用设置break

p3

# 画图，样品相关性热图p4 colD=data.frame(Group=group_list) exprSet=t(exp) rownames(colD)=colnames(exprSet)#问题-exprSet设置成转置后的exp p4 <- pheatmap::pheatmap(cor(exprSet),#热图对样本-列操作 annotation_col = colD, show_rownames = F, show_colnames = F, main = gse_number ) p4

出图如下：

标准步骤之limma差异分析

代码如下：

library(limma) #因为是配对样本，所以要生成一个有效的pairinfo和group，来进行配对分析，注意关注两个参数的设置逻辑~ m=vector() for (i in 1:22) { m=c(m,rep(i,times=2)) } pairinfo = factor(m) design <- model.matrix(~group_list+pairinfo) exprSet=as.data.frame(t(exp)) dim(exprSet) library(tidyr) fit <- lmFit(exprSet,design) fit <- eBayes(fit) options(digits = 4) #设置全局的数字有效位数为4 deg = topTable(fit,coef=2,number=Inf,adjust='fdr')

差异分析结果前10行如下所示：

> deg[1:10,] logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val B MAL -3.5154 10.802 -13.802 8.572e-13 7.359e-09 18.88 KRT4 -3.8327 11.516 -12.814 4.060e-12 1.743e-08 17.48 SASH1 -1.1653 9.229 -11.518 3.599e-11 1.030e-07 15.48 TGM3 -3.5633 9.432 -11.011 8.873e-11 1.904e-07 14.64 PLOD3 0.5634 8.631 9.822 8.268e-10 1.420e-06 12.54 ITPR2 -0.6529 7.214 -9.703 1.043e-09 1.493e-06 12.32 KLK13 -2.0788 8.963 -9.510 1.527e-09 1.873e-06 11.96 GPD1L -1.1166 6.864 -9.233 2.660e-09 2.686e-06 11.43 SPINK5 -2.9586 9.547 -9.205 2.816e-09 2.686e-06 11.38 SPP1 2.9068 8.126 9.146 3.174e-09 2.725e-06 11.26

有了差异分析就可以进行标准的可视化，包括火山图和上下调的差异基因热图

nrDEG=deg head(nrDEG) attach(nrDEG) plot(logFC,-log10(P.Value))#简单画图看一下 df=nrDEG df$v= -log10(P.Value) #df新增加一列'v',作为新的绘图参数，值为-log10(P.Value) #设定上下调基因 df$g=ifelse(df$P.Value>0.05,'stable', ifelse( df$logFC >0.5,'up', ifelse( df$logFC < -0.5,'down','stable') ) ) #统计上下调基因数量 table(df$g) #给绘制火山图用的数据新增一列symbol df$name=rownames(df) head(df) logFC_t = 0.5 #设置可循环使用的plot标题 this_tile <- paste0('Cutoff for logFC is ',round(logFC_t,3), '\nThe number of up gene is ',nrow(df[df$g == 'up',]) , '\nThe number of down gene is ',nrow(df[df$g == 'down',]) ) #画图，火山图p5 p5 <- ggplot(data = df, aes(x = logFC, y = -log10(P.Value))) + geom_point(alpha=0.6, size=1.5, aes(color=g)) + ylab("-log10(Pvalue)")+ scale_color_manual(values=c("#34bfb5", "#828586","#ff6633"))+ geom_vline(xintercept= 0,lty=4,col="grey",lwd=0.8) + xlim(-3, 3)+ theme_classic()+ ggtitle(this_tile )+ theme(plot.title = element_text(size=12,hjust = 0.5), legend.title = element_blank(), ) p5

#热图 library(pheatmap) x=deg$logFC names(x)=rownames(deg) cg=c(names(head(sort(x),100)), names(tail(sort(x),100)))#对x进行从小到大排列，取前100及后100，并取其对应的探针名，作为向量赋值给cg n=t(scale(t(dat[cg,]))) n[n>2]=2 n[n< -2]= -2 n[1:4,1:4] pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F) ac=data.frame(group=group_list) rownames(ac)=colnames(n) # 画图，上下调的差异基因热图p6 p6 <- pheatmap(n,show_colnames =F, show_rownames = F, cluster_cols = T, main = gse_number, annotation_col=ac) p6

出图如下:

标准步骤之生物学功能数据库注释

我们这里不根据任何武断的阈值来区分统计学显著的上下调基因，而是直接根据基因的变化情况排序进行gsea分析，而且仅仅是展示kegg这个生物学功能数据库的注释情况！

gsea分析需要基因的ENTREZID，需要根据物种进行转换

# 加ENTREZID列，用于富集分析（symbol转entrezid，然后inner_join） deg$symbol=rownames(deg) library(org.Hs.eg.db) library(clusterProfiler) s2e <- bitr(deg$symbol, fromType = "SYMBOL", toType = "ENTREZID", OrgDb = org.Hs.eg.db)#人 #bitr()用于SYMBOL转ENTREZID #其他物种http://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___OrgDb dim(deg) dim(s2e) setdiff(deg$symbol,s2e$SYMBOL) DEG <- inner_join(deg,s2e,by=c("symbol"="SYMBOL"))

gsea富集

library(dplyr) library(ggplot2) geneList=DEG$logFC names(geneList)=DEG$ENTREZID geneList=sort(geneList,decreasing = T) head(geneList) library(clusterProfiler) kk_gse <- gseKEGG(geneList = geneList, organism = 'hsa',#按需替换 #nPerm = 1000, minGSSize = 10, pvalueCutoff = 0.9, verbose = FALSE) tmp=kk_gse@result dim(tmp) kk=DOSE::setReadable(kk_gse, OrgDb='org.Hs.eg.db',keyType='ENTREZID')#按需替换 #DOSE::setReadable():mapping geneID to gene Symbol tmp=kk@result dim(tmp) pro='comp1' write.csv(kk@result,paste0(pro,'_kegg.gsea.csv')) save(kk,file = 'gsea_kk.Rdata')

富集可视化

上面的kk这个变量就存储了kegg这个生物学功能数据库的gsea分析结果，我们进行简单可视化，代码如下：

# 展现前6个上调通路和6个下调通路 down_k <- kk_gse[tail(order(kk_gse$enrichmentScore,decreasing = F)),];down_k$group=-1 up_k <- kk_gse[head(order(kk_gse$enrichmentScore,decreasing = F)),];up_k$group=1

dat=rbind(up_k,down_k) colnames(dat) dat$pvalue = -log10(dat$pvalue) dat$pvalue=dat$pvalue*dat$group dat=dat[order(dat$pvalue,decreasing = F),] # gsea分析结果p7 p7<- ggplot(dat, aes(x=reorder(Description,order(pvalue, decreasing = F)), y=pvalue, fill=group)) + geom_bar(stat="identity") + scale_fill_gradient(low="#34bfb5",high="#ff6633",guide = FALSE) + scale_x_discrete(name ="Pathway names") + scale_y_continuous(name ="log10P-value") + coord_flip() + theme_ggstatsplot()+ theme(plot.title = element_text(size = 15,hjust = 0.5), axis.text = element_text(size = 12,face = 'bold'), panel.grid = element_blank())+ ggtitle("Pathway Enrichment") p7 #具体看上面条形图里面的每个通路的gsea分布情况p8 library(enrichplot) p8 <- gseaplot2(kk, geneSetID = rownames(down_k))+ gseaplot2(kk, geneSetID = rownames(up_k)) p8

出图如下：

HNSCC数据分析-GSE6631-HG_U95Av2-GPL8300

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如果你也有类似的数据分析需求，却苦于不会写代码，可以考虑找我们的工程师帮忙哦！

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