京都大学 成功开发了利用光照射的超高分辨率基因分析技术 ~可以应用于组织内潜伏的癌细胞的病理诊断等~

科学技术振兴机构 九州大学 京都大学 成功开发了利用光照射的超高分辨率基因分析技术 ~可以应用于组织内潜伏的癌细胞的病理诊断等~

重点 以组织内潜伏的癌细胞和仅有极少数存在的细胞的基因分析困难的半导体制造技术为启发，成功开发了只对照射光的细胞进行基因表达的超高分辨率分析技术 可以低成本地进行基于COVID-19炎症组织和癌症组织标本的病理诊断

在JST战略性创造研究推进事业中，九州大学生物防御医学研究所的大川恭行教授和京都大学研究生院医学研究科的冲真弥特定副教授等的研究小组开发了光分离化学( Photo-Isolation Chemistry=PIC )技术，通过光照射成功检测到了在非常小的细胞集团和细胞中的微小结构体中发挥作用的基因。 已知人类和其他多细胞生物至少由100多种细胞类型组成，根据空间配置和位置的不同而具有进一步细分的功能和特性。 另一方面，如果从内脏器官和组织中取出这些细胞，就会失去本来的特性，因此需要在不破坏组织的情况下只对特定的细胞进行分析，但用以往的方法已经不可能了。 本研究小组以半导体制造工序的利用光的超微加工技术为灵感，开发了仅从照射光的区域提取基因表达信息( =分离)的技术。 利用被命名为PIC的这项技术，成功地向大脑的各个区域照射光，只检测出了每个区域工作不同的基因。 并且，从小鼠胎儿非常小的细胞集团和以前不可能的细胞内的1，000分之1毫米以下的微小结构体中也全面地检测到了基因。 作为被称为空间组学的研究领域成果的本技术领域，现在国际开发竞争正在加剧。 虽然许多这样的技术在使用上需要高额费用，但由于PIC只需要向现有的基因分析方法追加数百日元就可以实施，因此是预计在国际上普及的日本发明的独自技术。 今后，期待通过该技术加速癌症和COVID-19引起的炎症等混合了正常和异常细胞的临床组织在病理诊断中的应用。 本研究成果于2021年7月21日(日本时间)在科学杂志《Nature Communications》的在线版上公布。

研究代表者:大川恭行(九州大学生物防御医学研究所教授) 研究期间: 2016年度〜2021年度 JST在该领域支持以少数细胞为对象的分析技术的开发，上述研究课题正在实施其空间测量系统的开发。 战略性创造研究推进事业个人型研究(先驱) 研究领域:“多细胞系统中的细胞间相互作用及其动力学” (研究总结:高桥淑子京都大学研究生院理学研究科教授) 研究课题名称:“基于位置信息记录的多细胞系统分析” 研究者:冲真弥(京都大学研究生院医学研究科特定副教授) 研究期间: 2019年度〜2022年度

JST的目标是通过对构成组织器官个体等的细胞集团进行时空分析，将生命现象理解为一个系统。

<研究背景和经过> 人类的身体由数十兆个细胞组成，至少存在100种以上的细胞类型。 另外，根据立体配置和场所的不同，会产生更加多样和细分的功能和特性。 这种多样性是由基因表达的差异赋予的。

例如，大脑海马大致分为立体弯曲结构的CA1区、CA3区、齿状回等区域，通过各自表达不同的基因来发挥记忆方面特有的功能。 从更微观的角度来看，即使是发育阶段还很小的胎儿，也有在空间上特异性表达的基因，从而有序地形成三胚层和神经等各种细胞类型。

另外，即使在1个细胞中，不同的地方存在不同的基因( RNA )，承担着维持细胞功能和恒常性的作用。 因此，为了理解空间上复杂的多细胞系统，了解哪个基因在生物体内的场所和微小区域表达是很重要的。

另外，由于在癌症和炎症等病理组织中正常和异常的细胞复杂地混合在一起，有必要将两者好好区别开来。 也就是说，如果能够只分离异常细胞来调查基因的话，就有望制定出正确的诊断和治疗战略。

那么，基因表达在空间上的分布该如何调查呢？ 自古以来就有ISH法注1 )和免疫染色法等技术，通过对目标基因产物( RNA和蛋白质)进行染色，对其空间分布进行了研究。 虽然在基础生命科学领域至今仍是众多研究者使用的实验技术，但其缺点是一次实验只能调查23个基因。

现在，由于高速序列技术的普及，可以从磨碎的内脏器官和组织中一次调查数万个基因。 但是，要想对目标细胞进行特殊的基因分析，必须从周围的组织中取出(分离)该细胞。

但是，传统的物理切除法和通过酶等进行的生物化学分离法，会对细胞造成刺激和损伤，因此原本的基因表达信息受损是个问题。 另外，由于正确分离各个细胞和微米以下的结构体非常困难，所以不可能全面调查微小环境中的基因表达。

<研究内容> 为了开发分析微小领域基因表达的技术，本研究小组着眼于完全不同的科学技术。 那是半导体的制造技术。 在被称为光刻的制造工序中，向硅基板的表面照射比1微米细的光，使基板的性质发生变化，形成超微细的布线和元件。 这是一种可以在毛发截面上划出100多条线的精细加工技术。 也就是说，光可以进行超微细的照射，而且可以产生化学上的变化。

以此为提示，本研究小组构思出了用光照射组织和细胞内的超微区域，只分离出化学性质发生变化的基因信息的想法。 此次开发的光分离化学( Photo-Isolation Chemistry=PIC )由1 )逆转录反应注2 )、2 )光照射、3 )基因扩增反应3个步骤组成(图1 )。

1 )首先，制作冻结的内脏器官和组织的薄切片。 在此基础上滴入用于读取基因序列的短链DNA (引物)，通过逆转录反应将基因的RNA转换为DNA。 在PIC中，其引物与通过光照射而裂解的化合物(光裂解性拦截剂)结合。

2 )接着，用光照射目标细胞。 此时，拦截器只在照射的区域从底漆上脱落。

3 )溶解所有的细胞，提取逆转录的DNA，但是，其中混有带抑制剂的和因光照射而脱落的。 如果用IVT和PCR的方法对其进行基因扩增反应，则只有拦截物脱落的物质才能被扩增，从而读取基因序列。

也就是说，通过PIC可以只读取光照射区域的基因信息。

为了证明其原理，本研究组对大脑海马的CA1区、CA3区、或齿状回分别进行了光照射，进行了PIC (图2 )。 结果，确定了各领域中特异表达的基因约1，000种。 特别是在CA1区，Ociad2和Wfs1基因的表达量，在CA3区，Dkk3基因的表达量，在齿状回中，Prox1和Pdzd2基因的表达量被判定为高，已经报道的用ISH法进行组织染色的结果和表达模式一致。 由此证明，PIC只能检测光照射区域中存在的基因。

接着，本研究小组对更小的细胞集团进行了PIC (图3 )。 小鼠胎儿有被称为神经管的、将来成为脊髓来源的细胞集团。 已知其背侧、腹侧、中央部表达不同种类的基因，产生不同类型的神经，但由于太小，各区域的基因表达的全貌尚不清楚。 本研究小组对这三个领域分别照射直径75微米(与毛发直径大致相同)的光进行了PIC。 结果，从各个区域检测出了约1万种基因。 发现其中约200个基因在各区域特异表达。

特别是用ISH法确认了背侧被判定为特异性的基因后，证明了确实在神经管的背侧有很强的表达。 结果显示，PIC能够检测出存在于毛发截面那么微小区域的基因。

最后，本研究小组在更小的微小结构体中活用了PIC (图4 )。 细胞中有直径数微米的核，其中有被称为核散斑的数百纳米(毛发粗细的百分之一左右)的粒子。 虽然已知核斑点中含有丰富的各种RNA，但具体是哪个基因的RNA几乎不清楚。

本研究小组用光照射核散斑或其他核内区域，进行了PIC。 结果表明，两者均可检测出1万种基因信息，另外，通过两者的比较，发现核斑点中含有约1，000种基因的RNA较多。 其中有已知核散斑中含有丰富的MALAT1基因的RNA。

另外，用ISH法分析了迄今为止尚不清楚的其他核斑点中含有的多种基因，证明了例如AKR1C2基因的RNA存在于核斑点及其周边。

<今后的展开> 以前，由于无法从物理上、生物化学上取出核斑点等微小结构体，所以无法弄清其中所含基因的全貌。 PIC不是取出微小结构体本身，而是只用光拾取基因信息的新概念。

这次，能从核斑点等微小结构体中定量检测出1万种基因信息真是可喜可贺，PIC对微细区域的检测灵敏度和分辨率达到了世界最高水平。 PIC受半导体制造技术的启发，凝聚了化学、光学、分子生物学的知识，是全日本开发的基因分析技术。

本开发是被称为空间组学的研究领域的成果，在该领域，为了调查空间基因表达的技术，国际上的开发竞争正在激烈。 虽然大部分都是需要高额设备和运行成本的技术，但是PIC的最大优点是只需要向现有的基因分析方法追加几百日元就可以实施。

因此，与传统的ISH法和免疫染色等染色技术相比，可以低成本、高分辨率地分析更多基因的空间分布。 因为它可以直接应用于人和动物等所有多细胞生物的基础研究中，所以可以解释立体组织形成和细胞分化相关的基因，加速与再生医疗相关的研究。

PIC也可以直接用于临床组织的病理诊断。 在癌症患者的诊断中，会对组织标本进行染色，判定恶性度和制定治疗战略，但是由于癌症组织中混杂着正常和异常的细胞，因此很难将它们分离并分析基因。 另外，在溃疡性结肠炎和COVID-19等引起的炎症组织中，正常组织中异常的炎症性淋巴细胞错综复杂，因此难以区分和分析这些疾病。

如果有效利用PIC的话，可以只向异常的细胞照射光，一下子读取那些基因信息。 因此，深入调查异常细胞的性质，有望应用于更正确的诊断和有效的治疗方针的制定。

图1 PIC的原理①将带有光裂解性拦截剂的引物滴在切片上。 之后，通过逆转录反应将基因的RNA转换为DNA。 ②光照射目标细胞后，拦截器会从引物上脱落。 ③只有光照射的细胞的基因被放大。

图2对海马的PIC  a）制作脑的切片，对海马的CA1、CA3、或齿状回进行光照射并做PIC。 b）其结果，判断为CA1上Ociad2和Wfs1、CA3上Dkk3、齿状回上Prox1和Pdzd2基因表达量高，这与做ISH的先行论文结果一致。

图3对小鼠胎儿的PIC   a）制作小鼠胎儿的切片，将光照射神经管的背侧、腹侧、或中央部进行了PIC。b）其结果，判断为Dcx、Hoxb8、Zic1、Hoxb8基因等表达量背侧高。c）进行上述基因的ISH结果，证明了全都是在背侧很强地表达。

图4对核散斑的PIC a）将光照射细胞核中的核散斑或其以外的核内区域进行了PIC。b）其结果，判断为AKR1C2和MALAT1基因在核散斑多。c）进行上述基因的ISH结果，证明了哪个都存在于核斑点及其周边。

<用语解说> 注1 )ISH (原位混合)法 细胞中有数万种基因被转录为RNA，但只对其中一种RNA进行染色的技术。 如图3c和图4c所示，可以看到各个基因的空间分布。

注2 )逆转录反应 现在广泛普及的高速序列技术可以读取DNA的碱基序列，但不能读取RNA。 也就是说，作为RNA表达的基因无法直接读取。 因此，一般通过逆转录反应将RNA转换为DNA。 其逆转录反应需要引物，通过在那里添加光裂解性拦截剂，完成了PIC的发明。

<论文标题>“High-depth spatial transcriptome analysis by photo-isolation chemistry”“高深度空间基因分析技术”(基于光分离化学的高灵敏度空间基因表达分析技术的开发) DOI:10.1038/s41467-021-24691-8

<咨询方式> <有关研究的事情> 大川恭行 九州大学生物防御医学研究所转录学领域教授 〒812-0054福冈市东区马出3-1-1合作站2F 205室 092-642-4531

E-mail：yohkawa[at]bioreg.kyushu-u.ac.jp

冲真弥(オキ シンヤ) 京都大学研究生院医学研究科创药医学讲座特定副教授 邮编〒606-8507京都市左京区圣护院川原町53南部综合研究1号馆404号室 〒812-0054福冈市东区马出3-1-1合作站2F 205室 075-366-7479

E-mail：oki.shinya.3w[at]kyoto-u.ac.jp

<关于JST事业的事情> 保田睦子（ヤスダ ムツコ）科技振兴机构战略研究推进部生命创新小组 〒102-0076东京都千代田区五番町7 k’s五番町 03-3512-3524传真: [phone]

E-mail：crest[at]jst.go.jp

<新闻负责人> 科学技术振兴机构宣传科 邮编〒102-8666东京都千代田区四番町5番地3 03-5214-8404传真: [phone]E-mail：jstkoho[at]jst.go.jp九州大学宣传室 092-802-2130传真: [phone]E-mail：koho[at]jimu.kyushu-u.ac.jp京都大学总务部宣传科国际宣传室 075-753-5729传真: [phone]E-mail：comms[at]mail2.adm.kyoto-u.ac.jp