单细胞测序中子宫内膜细胞悬液制备

背景介绍

子宫内膜由单层柱状上皮和固有层组成。上皮由纤毛细胞和分泌细胞构成，但分泌细胞多于纤毛细胞。固有层很厚，由疏松结缔组织构成，含有较多网状纤维、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞，丰富的血管、淋巴管和神经，此外，还有大量分化程度较低的梭形或星形细胞，称基质细胞。基质细胞核大而圆，胞质较少，可随妊娠与月经周期变化而增生分化。

本实验中用到的酶包括透明质酸酶、胶原蛋白酶Ⅳ和脱氧核糖核酸酶I。

子宫组织及示意图

实验仪器及耗材

消化液(40mL) ⭐现配现用

• 20 mL HBBS，300 µL 胶原酶 IV，132 µL透明质酸酶，40 µL DNase1

实验步骤

1. 分离150mg—200mg组织，在组织上划几刀，但不要切断。
2. 将步骤1的组织放入10mL的透明质酸酶溶液中，37°，摇床200转，5-10分钟。
3. 使用100μm细胞过滤器过滤细胞悬液，去除组织，用10mLDMEM/FBS冲洗过滤器（这个步骤非常重要），600g离心5分钟，用100μLDMEM/FBS重悬细胞后放置在冰上。
4. 重悬后的组织加入10mL消化液，37°，摇床200转消化30分钟。
5. 使用100μm细胞过滤器过滤细胞悬液。
6. 组织用10mL消化液重悬后继续消化，37°，摇床200转消化30分钟。
7. 用10mLDEME/FBS清洗过滤器，过滤后的悬液，600g离心5分钟，用100μLDMEM/FBS重悬细胞后放置在冰上。
8. 步骤6中的组织消化后按步骤5，收集细胞过滤液，离心并用DMEM/FBS重悬后放置在冰上。组织则继续加入10mL细胞消化液消化，条件不变。
9. 重复步骤8两次，消化时间改为20分钟。
10. 最后一次弃组织，混合收集到的500μL细胞上清液。
11. 加入4.5mL红细胞溶液。
12. 使用涡轮振荡器震荡5秒后室温静置2分钟。
13. 600g离心5分钟，去上清，沉淀用500μL DMEM重悬。
14. 用2mL PBS/0.04%BSA清洗三次，每次离心时间为5分钟，600g。
15. 用2 mL PBS/0.04% BSA冲洗离心管。
16. 300g，离心3分钟。
17. 用2 mL PBS/0.04% BSA冲洗离心管。
18. 300g，离心3分钟。
19. 用2 mL PBS/0.04% BSA冲洗离心管。
20. 最后一次冲洗使用100μm细胞过滤器过滤。
21. 用1mL DMEM/10%FBS重悬沉淀。
22. 通过细胞计数仪检测细胞活性大于等于85%，背景干净，结团率小于5%，细胞量大于等于5万；可用于后续单细胞测序建库实验。

制备结果

注意：子宫内膜中含有较多红细胞，在解离过程中需将红细胞充分裂解。