CRISPR/Cas9基因编辑技术大热，非病毒载体技术助力递送系统优化

络绎学术 Online 直播第 12 期，我们邀请到了浙江大学教授、博士生导师平渊教授为我们分享基因编辑非病毒载体在疾病治疗中的应用。

基因编辑技术

基因编辑技术 (genome editing) 可以精确地破坏、插入或替换基因组中特定位点的 DNA 序列, 在基因功能的研究和遗传疾病的治疗中发挥着巨大的作用。人工核酸内切酶 (engineered endonuclease, EEN) 介导的基因编辑技术极大地改善了早期基于同源重组的基因打靶技术 (gene targeting) 效率低的问题, 使得科研工作者可以高效地对各种细胞类型和生物的任何基因进行编辑。

图 | 基因编辑过程的三个步骤

目前，归巢核酸内切酶 (Meganuclease)、锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases, TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 及其相关蛋白这 4 类工具酶，在基因编辑技术中应用最多。

无论是 ZFN、TALEN 还是 CRISPR / Cas9，它们都是由 DNA 识别域与核酸内切酶两部分组成，在结构上具备相似性。其中 ZFN 技术具有锌指结构域能够识别靶点 DNA，而 TALEN 的 DNA 识别区域是典型串联 TALE 重复序列的中央结构域，DNA 剪切区域是一种名为 Fokl 的核酸内切酶结构域。CRISPR 的 DNA 识别区域就是 crRNA 或向导 RNA，Cas9 蛋白负责 DNA 的剪切。当 DNA 结合域识别靶点 DNA 序列后，核酸内切酶或 Cas9 蛋白将 DNA 剪切，靶 DNA 双链断裂，再启动 DNA 损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。

图 | ZFN 、TALEN 、 CRISPR 靶向切割 DNA 对比

在作用过程上，它们也具有相似性。通过 DNA 识别模块对特异性的 DNA 位点识别并结合，然后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切，从而借助于细胞内固有的 HDR 或 NHEJ 途径修复过程完成特定序列的插入、删除及基因融合。

图 | ZEN、TALEN 、CRISPR 的不同之处对比

通过和与其他技术的多方面对比，我们可以看到 CRISPR / Cas9 技术既有优势，也有限制。那么 CRISPR / Cas9 技术的前世今生又有什么样的故事呢？

基因编辑“魔剪”——CRISPR

1987 年，日本微生物学家石野良纯首次发现 CRISPR 。2012 年 Scribe Therapeutics 公司创始人之一 Jennifer Doudna 博士与 Emmanuelle Charpentier 博士利用 CRISPR 完成基因编辑。CRISPR 被认为是 21 世纪最重要的发现之一，于 2012 年、2013 年、2015 年 3 次入选 Science  评选的“世界十大科学突破”。

规律成簇的间隔短回文重复序列 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats sequences, CRISPR) 是能为细菌和古生菌提供对病毒和质粒的适应性免疫的 DNA 重复序列。CRISPR 基因序列主要由前导序列 (leader)、重复序列 (repeat) 和间隔序列 (spacer) 构成。2002 年，Jansen 实验室将临近 CRISPR locus 的基因命名为 cas (CRISPR-associated) ，并发现了 4 个 cas 基因 (cas1, cas2, cas3, cas4)。

CRISPR / Cas 系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的 DNA 切断而使之失效。

CRISPR 系统有 Ⅰ 型、Ⅱ 型和 Ⅲ 型，其中 CRISPR / Cas9 作为 Ⅱ 型研究最多，是继锌指核酸内切酶 (zinc finger nuclease，ZFN) 、类转录激活因子效应物核酸酶 ( transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN) 之外出现的第 3 代基因编辑技术，其介导的基因编辑可用于生成转基因模型、调节转录、调控表观遗传等。

CRISPR / Cas9 系统主要是由 Cas9 蛋白和单链向导 RNA (sgRNA) 组成，其中 Cas9 蛋白具有切割 DNA 双链功能，sgRNA 起导向作用。在原型间隔区相邻的基序 (protospacer adjacent motif, PAM) 存在的情况下，Cas9 蛋白能在 sgRNA 导向作用下通过碱基互补配对到达不同的靶部位，切割靶基因实现 DNA 双链断裂 (double strand break, DSB) 。

CRISPR/Cas9 技术工作中的 3 个关键因素

• 向导 RNA：定位目标基因的一部分 RNA。这是在实验室中设计的；

• CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9)：剪掉不需要的 DNA 片段的“剪刀”；

• 供体 DNA：原 DNA 链被剪断之后插入的所需的 DNA 片段。

图 | CRISPR - Cas9 介导的基因组编辑示意图

DSB 修复主要有两种机制， 分别是非同源末端连接修复 NHEJ 和同源重组修复 HDR 。非同源末端连接 (non-homologous end joining, NHEJ) , NHEJ 介导的修复可在 DNA 双链断裂位点产生不精确的可变长度的插入和/或删除突变。其它的非同源重组修复途径也是存在的，比如微同源末端连接 (MMEJ, Microhomologymediatedend joining) 和单链退火途径 (SSA, Single-strand annealing)。

非同源修复的三种途径 NHEJ 、MMEJ 和 SSA 的区别较为明显。

/ NHEJ 途径修复 DSB 损伤是通过末端直接相连的方式进行的，这种连接不需要大片段的同源序列识别，而只需要 1-5 bp 的碱基配对就可以进行修复，属于一种易错修复。

/ 与 NHEJ 修复途径比较，MMEJ 修复与其最大的差别在于所识别的同源序列长度的不同。MMEJ 修复途径需要 5-25 个碱基同源序列，会常常造成连接处发生同源片段的缺失或者基因重排。这也属于易错修复。

/ 与 NHEJ 和 MMEJ 途径相比较，SSA 途径需要更长的同源序列 (>30bp) 来进行识别。SSA 途径可以导致基因组的缺失，这是其与 MMEJ 途径所类似之处。此外，SSA 与同源重组途径类似，也被归属为同源序列依赖型的 DSB 修复模式，两者都需要通过 5’到 3’的 DNA 剪切，产生 3’突出的单链 DNA。

图 | 非同源修复的三种途径

同源重组修复 (homology-directed repair, HDR) ，HDR 介导的精确修复可以从单链或双链 DNA 供体模板引入精确的点突变或插入突变。“同源重组”机制在双链 DNA 修复中具有十分重要的细胞生物学意义。DNA 同源重组修复是一条涉及到多个步骤的复杂的信号通路，其中关键蛋白为 BRCA1 和 BRCA2。如果 BRCA 基因出现突变导致 BRCA1 和 BRCA2 蛋白失去功能，就会引起 HRD 功能异常 (Homologous Recombination Deficiency, HRD) 和PALB2, CDK12, RAD51, CHEK2, ATM 等相关基因突变、或 BRCA1 基因启动子发生甲基化导致基因组不稳定。当同源重组发生错误识别时，在非模板染色体执行“修复”可能会给细胞带来无法预估的伤害。比如，错误的识别来自另一个亲本的同源物，而不是姐妹染色单体作为模板来“修复”损伤的染色体。母本和父本染色体在许多位置上的 DNA 序列是不同的，因此，这种类型的修复可以将需要修复的 DNA 序列从母本转变为父本序列，或从父本转变为母本序列。

图 | 同源重组常导致基因 DNA 序列在染色体级别间互换

由于 CRISPR 具有简单、廉价和高效等优势，因此它已经成为全球最为流行的基因编辑技术，被称为编辑基因的“魔剪”。科学家通过它可以高效、精确地改变、编辑或替换植物、动物甚至是人类身上的基因，经过改造的 CRISPR 技术可被广泛地应用于生物医药和其他领域。

CRISPR 技术在许多领域的技术应用和联用都取得了重大反响，人们在安全性，道德和监管等方面对其关注度也日益上升。

CRISPR 技术应用前景广阔，在医疗、能源、农业、工业等领域有望大放异彩

开发新的诊断测试，靶向药物和治疗方法。通过将 CRISPR 与其他可切割目标 DNA 或 RNA 的 Cas 蛋白配对，然后切割其他分子以产生视觉信号，科学家可以确定何时存在病毒成分。科学家正在使用这项技术来开发诊断测试，以快速识别出诸如 COVID-19 之类的疾病。CRISPR / Cas9 正在测试用于某些疾病的可能治疗方法，包括镰状细胞性贫血和某些类型的癌症。CRISPR 也可用于通过改变昆虫或其他可传播疾病的生物的特性来帮助控制某些疾病。例如，科学家使用 CRISPR 使蚊子对引起疟疾的寄生虫更具抵抗力。

开发生物燃料。基因编辑可以提高藻类生物燃料的产量。利用 CRISPR / Cas9 技术，科学家能够找到并移除限制脂肪产生的基因。致力于研究商业化基因组学解决方案以解决全球能源与环境问题的美国生物技术公司 Synthetic Genomics 已经创造出了能产生两倍脂肪的藻类，然后用于生产生物柴油。迄今为止，藻类尚未产生足够高水平的脂肪以支撑生物柴油的大规模量产。通过 CRISPR / Cas9 技术，藻类将二氧化碳转化为生物燃料的效率有望大幅提高。Synthetic Genomics 目前正与石油公司埃克森美孚 (ExxonMobil) 合作。预计此次合作将实现到 2025 年，每天生产 10,000 桶（石油计量单位，每桶相当于 120 - 159 升）藻类生物燃料的目标。

更强壮，更抗病的农作物。CRISPR 可以通过增加营养成分，抗病性和在恶劣天气和土壤条件下的生存能力来改善农产品。在传统作物改良上，CRISPR 技术能带来产量、品质、抗病性和抗除草剂性等方面的提升。在农业育种和加速作物驯化方面，CRISPR 与其他技术的联用的创新层出不穷。目前，CRISPR 技术广泛应用于模式植物（拟南芥、烟草）和一些主要农作物，比如我们常见的水稻、小麦、玉米等。CRISPR 技术也促进了植物基因功能研究和预期农艺性状的选择。例如，当研究人员删除一小部分特定的黄瓜基因时，这些植物就不太容易受到已知会损害植物并造成严重农作物损失的病毒的侵害。CRISPR 基因编辑发明专家张锋教授、David Liu 先生和 Keith Joung 先生共同创立了一家名为 Pairwise 的新型农业公司。该公司致力于利用基因编辑技术，以新的方式利用农作物的自然多样性来应对全球粮食挑战。

更先进的工业产品。各个行业都在探索 CRISPR 潜在用途。除了开发新的生物燃料意外，可以解救环境灾难的细菌以及新材料也是工业产品与 CRISPR 技术联用的主要方向之一。专注于 CRISPR 的非治疗应用的创新技术公司 Caribou Bioscience 就提供了基于 CRISPR 的工具用以改善工业发酵过程，革新化学品和酶的生产过程。他们还用 CRISPR 操纵微生物，生产新的化学品。潜在的新型生物材料包括香精、香精和工业清洁产品。

图 | CRISPR 技术应用前景机遇与挑战共存

CRISPR 基因编辑也引起了人们对其安全、道德和监管这三方面的关注

安全问题。使用 CRISPR 可能会带来意想不到的后果。例如，它可以靶向 DNA 内的“意外”位置，从而产生可能导致疾病或其他伤害的变化。尽管一些研究表明错误可能很少见，但仍然有待研究。此外，CRISPR 活性可能使细胞受压并阻止编辑。虽然某些细胞可以在 DNA 改变后恢复，但很多细胞是不能恢复的。

道德问题。伦理问题包括 CRISPR 是否将用于增强人类特征，例如增加的肌肉质量、学习能力和记忆力，以及是否可以公平地利用所有人群等。使用 CRISPR 编辑人类繁衍的影响也引发了伦理学问题。例如，遗传变化会在多大程度上影响子孙后代，是否应该允许对人类胚胎进行研究等。

监管挑战。许多国家在如何规范 CRISPR 和其他基因编辑技术的问题上难以决断。例如，在美国，目前尚不清楚基因编辑的作物是否将受到与常规转基因 (GM) 生物相同的法规的约束。虽然 FDA 在 2017 年就开始寻求有关其监管政策的公众意见，但是针对这一技术的行业新指南迟迟未发布。而在欧洲，2018 年的一项法院裁决确定，基因编辑作物将与转基因植物受同样的法规约束。有关基因编辑技术的监管仍然存在诸多问题有待解决。

病毒载体

病毒是一类能对人体细胞及其它动物细胞进行有效感染的微生物。病毒的本领是把自己的基因高效地导入到宿主细胞里去，具有良好的基因递送效能。因此，病毒被科学家们改造成为进行基因治疗的主要递送工具。在基因治疗中使用最广泛的病毒载体包括逆转录病毒 (retro virus, RV) 和慢病毒 (lentivirus, LV) 、腺病毒 (adeno virus, Adv) 以及腺相关病毒 (adeno associated virus, AAV) 等载体。

逆转录病毒载体属 RNA 病毒，但可在受染细胞内反转录产生 DNA 互补链，此 DNA 单链可作为模板合成第二条 DNA 链，第二条 DNA 链可掺入细胞基因组 DNA 中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA 可合成蛋白，再包装病毒，RNA 从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。

慢病毒属在分类上属于逆转录病毒科，包括 8 种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主，导致感染个体发病。慢病毒载体是一种单链 RNA 病毒，目前较为常用的病毒系统是四质粒系统。与其他逆转录病毒相比，慢病毒载体具备宿主更广泛、对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，稳定表达和经过构建后可携带大约 5kb 及更长的目的基因的特点。

腺病毒是无胞膜的线性双链DNA病毒，目前腺病毒科分为 5 个属。在临床和科研中，主要使用的是 Adv5 型腺病毒载体。腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，属于非整合型的病毒载体，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。腺病毒载体还具备宿主范围广、对人致病性低、在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因、有效增殖滴度高、无插入致突变性、能在悬浮培养液中扩增、能同时表达多个基因的特点。

腺相关病毒是一类单链线状 DNA 缺陷型病毒，属微小病毒科。腺相关病毒基因组 DNA 小于 5kb，无包膜，外形为裸露的 20 面体颗粒。腺相关病毒载体具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点。因此在神经系统的体内和体外研究中，腺相关病毒载体备受关注。

目前病毒载体仍然是临床试验的主流载体。病体载体的优点是转染效率高，但是缺点则包括特定人群无法使用、包装容量有限、免疫原性强和缺乏组织靶向性等。其中，慢病毒宿主范围广, 基因容量大，感染效率高, 能整合基因到宿主细胞，实现长期稳定表达，常构建稳定株；腺相关病毒免疫原性低，多种血清型，体内扩散能力强，常用用于体内研究；腺病毒携带外源基因片段大，感染效率高，主要用于体外难感染的细胞。

图 | 病毒载体技术对比

当然，其他类型的病毒载体也有很多，比如牛痘苗病毒 (vaccinia virus, VV)、单纯孢疹病毒 (herpes simplex virus, HSV)、噬菌体载体等。以 HSV 病毒为例，HSV 病毒的滴度高、宿主范围广、外源基因容量大、对神经细胞具有特异性，但其毒性和免疫原性等因素有待进一步验证。因此，HSA 病毒载体并未被广泛应用。

非病毒载体

非病毒载体的使用原理是采用人工合成的载体材料的物理化学性质来介导基因的转移。与病毒载体相比较，非病毒载体具有安全性高、包装尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控的优点，相对于病毒载体，非病毒载体成本较低、制备更简单，便于大规模生产。在表达反义寡核苷酸等特殊外源基因片段中，病毒载体有着传统病毒载体不可替代的作用。

目前，正在研究的非病毒载体主要包括脂质体、分子偶联受体、聚合物（聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺等）、复合载体以及纳米粒子载体等。常用的基因转移脂质体包括阳离子、中性和阴离子脂质体，其中阳离子脂质体研究的最为广泛；而应用于基因转移的无机纳米粒子主要包括硅、碳纳米管、铁氧化物等，它们主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生物体中而起到治疗疾病的作用。虽然非病毒载体仍存在转染效率较低等问题，但是他们在基因治疗领域扮演者越来越重要的角色。

图 | 非病毒载体的特点

以基于脂质、类脂质的非病毒载体为例。阳离子脂质和类脂质载体可以借助静电相互作用装载核酸。目前这类非病毒载体 microRNA、siRNA 和 shRNA 等的递送中得到了较为广泛的应用。 同理它们也可递送基于质粒 DNA、mRNA、RNP 的 CRISPR/Cas9 系统。很多结构新颖、性能优良的脂质和类脂质材料被设计出来用于载体构建, 这些载体往往需要 PEG 修饰。脂质载体经过 PEG 修饰实现长循环，通过被动靶向作用可蓄积于肿瘤组织，对其进行配体修饰或对脂质进行结构改造可以增强载体的靶向性, 促进细胞摄取，提高递送效率。这类载体在屏蔽载体正电荷, 减少蛋白吸附后，其循环稳定性也得以提高，更能达到人体给药的要求。

图 | 用于递送 CRISPR / Cas9 系统的非病毒载体

高分子聚合物由短链重复单元聚合而形成。重复单元的结构高度可控的特点让高分子聚合物可以根据所载物质的响应性需求被进行精确的设计。在结构上的多样性和功能上的全面性让高分子聚合物在递送 pDNA 时的可能性更加宽阔。

常用于递送蛋白质的纳米载体包括胶体纳米颗粒（如脂质体和固体脂质纳米颗粒）、聚合物纳米材料（如聚合物膜、纳米胶囊以及胶束）、无机纳米载体（如碳纳米管、量子点、介孔二氧化硅、磁性纳米颗粒、金纳米颗粒、金属有机框架、黑磷纳米片）等。磁性纳米颗粒可以作为磁共振成像的造影剂；金纳米颗粒可以产生光热效应；量子点颗粒可以进行示踪成像；还有些纳米颗粒可同时搭载药物与基因。这类非病毒载体不仅能将基因药物有效递送入细胞内，也能通过外部干扰达到最佳的抑癌作用。

非病毒载体虽然优点明显，但是非病毒载体在 CRISPR / Cas9 系统递送过程中仍存在不少问题，比如在如何免受网状内皮系统 (reticuloendothelial system, RES) 的识别及清除、如何实现该纳米粒子在特定位置的富集、如何穿越由磷脂双分子层所构成的呈疏水性的细胞膜等。

可溶微针辅助基因治疗，递送糖皮质激素类药物呈现新路径

浙江大学药学院平渊教授团队采用高特异性靶向 NLRP3 的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 基因编辑技术，并以高效的经皮微针给药糖皮质激素的方式有效治疗炎症性皮肤病 (ISDs)，该研究以题为 'Microneedle-assisted genome editing: A transdermal strategy of targeting NLRP3 by CRISPR-Cas9 for synergistic therapy of inflammatory skin disorders' 的论文发表在 Science 子刊《Science Advances》上。这一研究成果让可溶性微针贴片基因编辑治疗走进了人们的视野。

炎症性皮肤病 (ISDs) 是最顽固的疾病之一，其特征通常是通过产生促炎细胞因子来激活先天性和适应性免疫应答。银屑病和特异性皮炎 (AD) 等炎症性皮肤病日益流行，成为威胁公共健康的主要问题之一。目前，患者仅能从少数的药物中选择治疗方案，尽管糖皮质激素和免疫抑制剂是一线治疗方案，但是经长期治疗后大多数患者对糖皮质激素产生耐药性，治疗效果有限。因此，研发替代性的治疗选择是为糖皮质激素产生耐药性的患者提供医疗方案的一个重要突破点。

多数研究表明 NLRP3 激活与糖皮质激素耐药性之间存在很强的相关性，虽然干扰激活NLRP3 上游的相关因子起间接作用以达到治疗目的的小分子抑制剂相关研究众多，但是口服后，能够到达皮下层的药物含量十分有限，并未达到高效的治疗目的。因此提高安全性和有效性成了这一研发方向上的重中之重。

平渊教授团队开发的可溶性微针 (MN) 贴剂，微针中包封有靶向 NLRP3 的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 的纳米复合物，以及含有地塞米松 (Dex) 的纳米复合物。当扎入皮肤后，微针可以快速溶解释放两种纳米复合物，随后被角质细胞和周围的免疫细胞内化，从而有效治疗皮下层炎症。微针能透皮递送 Cas9 RNP 和 Dex 纳米复合物，破坏皮下细胞内 NLRP3 炎性小体，与 Dex 协同治疗作用下能有效治疗特异性皮炎 (AD) 和银屑病。

在筛选出 sgRNAs 序列时，发现 CMAX（一种商用转染试剂）介导的 DC2.4 和 3T3 细胞中对 NLRP3 基因位点进行编辑，Indel 效率高达 35.4% 和 32.5% ，且也经过 Sanger 测序证实。此外，实验发现在 DC2.4 细胞中添加 PLGA/Dex 纳米复合物后，NLRP3 基因组位点的 Indel 效率从 29.6% 提高到 36.2% 。3T3 细胞中，Indel 效率也从 19.1 提高到 31.7%。结果证实，Dex 纳米复合物中的 PLGA 可能会扩张核孔，促进Cas9 进核，提高对 NLRP3 基因位点的编辑活性。

通过微针介导的分级递送经皮治疗策略，可最大限度地发挥基因编辑和糖皮质激素协同治疗的治疗效果。这一方法不仅在炎症性皮肤病的治疗方面极具潜力，而且也为经皮给药和基因编辑疗法的联用提供了新的思路。

由于目前非病毒载体基因治疗领域的研究还是大多是在体外进行的，且体内外结果有一定差异。因此未来非病毒载体基因治疗的发展与体内研究将更加关联。

目前已经上市的非病毒产品代表

Neovasculogen

首个非病毒基因治疗产品，由俄罗斯人类干细胞研究所 (Human Stem Cells Institute)  于 2012 年推出；由一个编码血管内皮生长因子 (VEGF-165) 的质粒载体组成；适应症：治疗严重肢端缺血。

Collategene

日本 AnGes 公司推出，已于 2019 年被批准适用于日本国民健康保险。Collategene 由pVAX1-HGF 组成，在人体内表达 HGF728 一种异构体。其主要适应症为治疗闭塞性动脉硬化症和血栓闭塞性脉管炎。

Spinraza (Nusinersen)

美国 Biogen 和 Ionis 制药联合开发，2017 年经 FDA 批准上市。它通过与 SMN2 基因转录形成的 mRNA 相结合，改变 RNA 的剪接过程，从而增加正常 SMN 蛋白的表达量。因此，这一疗法可以在 SMN1 基因失活的 SMA 患者身上增加正常 SMN 蛋白的水平，从而维持运动神经元的生存。其主要适应症是治疗儿童和成人的脊髓性肌萎缩症。

非病毒和病毒载体均已实现用于各种应用的 CRISPR / Cas9 的递送。基因治疗也已经从基础研究向药物开发和工业化生产进行模式转变。基因治疗在治疗血液瘤和罕见病领域市场空间充足，未来可期。随着研发水平的提升和制备条件的改善，科学研究和临床需求的结合程度与转化流程的不断提升，未来在保险支付的支持下，基因治疗也终将有走进寻常百姓家的一天。

关于络绎知图

络绎知图是集科技数据、智能分析、学术服务于一体的科技大数据平台，以透视未来的科技本质为使命，面向学者、高校、科研机构以及从事科研成果转化的相关群体，提供研究型数据库、分析工具、学术会议、学术社区等功能，并通过媒体传播原创研究有效放大学术研究的影响力。