比较 | 四种不同来源巨噬细胞诱导方案
为探讨 人外周血单核细胞、人多能干细胞(hPSC)、人脐血CD34＋造血干细胞和人白血病细胞系THP-1 这四种来源巨噬细胞诱导方案的区别，我们通过监测不同诱导条件下巨噬细胞表型分子及其功能形态，确定这四种来源巨噬细胞的功能。
实验方法：选择上述四种来源巨噬细胞作为研究对象，对其研究内容主要包括：①形态观察；②采用流式细胞术对其表型分子进行检测。
实验一：人外周血单核细胞诱导成巨噬细胞实验方案
1、实验Protocol
注释：免疫磁珠纯化CD14 单核细胞体外诱导成巨噬细胞
2、实验结果展示
（1）磁珠分选纯度流式鉴定结果图
磁珠分选前PBMC中单核细胞占比10%，分选后CD14阳性率为85.8%，代表磁珠分选技术可以获得高纯度的CD14单核细胞，如下是结果图：
注释：黑色为同型对照，红色的峰代表样本管
（A：分选前PBMC样本 B：分选后阴性成分 C：分选后阳性成分）
（2）巨噬细胞形态特征结果图
细胞培养24h之后，大部分开始贴壁，细胞体积仍然比较小，少部分开始伸出伪足；培养到第3天，细胞体积增大，伪足开始变得明显；培养到第6天，伪足没有进一步增加或者伸展，细胞贴壁牢固，体积开始进一步增大，较大的细胞直径可达40-50微米，形状从不规则逐渐变成椭圆形，大部分细胞呈煎蛋状，小部分细胞呈梭型，培养液中的悬浮细胞与第三天相比没有什么区别。
注释：从左到右依次是培养d1、d3、d6结果图
（3）巨噬细胞吞噬功能检测结果图
a：巨噬细胞培养到第7天，进行吞噬功能检测，流式细胞仪显示，巨噬细胞阳性率为46%，在数量上稍微减少，根据细胞的状态和贴壁生长方式可以判断基本上是巨噬细胞；
b：靶细胞和效应细胞共培养两个小时后，进行流式检测，见下图，82%的巨噬细胞（包含CD14 和CD14-）吞噬了淋巴瘤细胞，代表巨噬细胞有很强的吞噬能力。
3、实验结论
单核来源的巨噬细胞，通过应用免疫磁珠法分离CD14细胞，经过体外的诱导分化培养成巨噬细胞，可以建立高纯度的人外周血来源的巨噬细胞培养体系，为免疫细胞的后续研究提供基础。
实验二：人多能干细胞(hPSC)诱导成巨噬细胞实验方案
1、实验Protocol
注释：hPSC与AGM-S3基质细胞共培养及定向分化巨噬细胞
2、实验结果展示
（1）细胞形态结果图
收集与AGM-S3基质细胞共培养3 d(共培养早期)与14 d的hPSC，分别以细胞密度为5×105 /mL重悬于巨噬细胞定向分化培养液(IMDM中包含10% FBS、20 ng/mL SCF、20 ng/mL IL-6、10 ng/mL IL-3、5 ng/mL FLT3L、5 ng/mL TPO、50 ng/mL M-CSF)中，悬浮培养7 d。随后，更换培养基为IMDM(包含10% FBS、50 ng/mL M-CSF)，继续悬浮培养7 d，收集悬浮细胞备用。在倒置相差显微镜下观察hPSC与AGM-S3基质细胞共培养及定向分化过程中细胞形态变化。结果图如下：
注释：hPSC与AGM-S3基质细胞共培养过程中细胞形态图
(图1A：AGM-S3基质细胞形态。图1B：hPSC形态。图1C：采用维持培养基，hPSC与AGM-S3基质细胞共培养至d3时，hPSC克隆逐渐增大。图1D：更换为造血分化培养液后，hPSC与AGM-S3基质细胞共培养至d3时，hPSC克隆边缘铺出面积增大。图1E：更换为造血分化培养液后，hPSC与AGM-S3基质细胞共培养至d6时，hPSC克隆边缘铺出部分出现血管样结构。图1F：更换为造血分化培养液后，hPSC与AGM-S3基质细胞共培养至d12时，hPSC克隆边缘血管样结构沟壑中出现鹅卵石样细胞。图1G：更换为造血分化培养液后，hPSC与AGM-S3基质细胞共培养至d14时，hPSC克隆边缘出现大量鹅卵石样细胞。图1H：高倍镜下鹅卵石样细胞形态)。
（2）流式细胞仪检测结果
通过流式细胞术检测更换为造血分化培养液后，hPSC与AGM-S3基质细胞共培养d10(图2A)、d12(图2B)、d14(图2C)、d16(图2D)总细胞表面分子变化结果显示，共培养d10、d12、d16、d14时，CD34＋ CD45＋造血干、祖细胞比例分别为1.1%、8.6%、19.5%及36.8%
注释：hPSC与AGM-S3基质细胞共培养后流式细胞仪检测
实验三：人脐血CD34＋细胞诱导成巨噬细胞实验方案
1、实验Protocol
注释：免疫磁珠纯化CD34 造血干细胞体外诱导成巨噬细胞；
2、实验结果展示
（1）磁珠分选纯度流式鉴定结果图
流式细胞术检测结果显示，人脐血单个核细胞经CD34＋磁珠分选试剂盒分选前，CD34＋造血干/祖细胞约占人脐血单个核细胞的4.0%；分选后，CD34＋细胞比例达87.9%；
注释：人脐血单个核细胞经CD34＋磁珠分选前、后结果图
(图4A：分选前检测结果；图4B：分选后检测结果)
（2）巨噬细胞形态结果图
分选后CD34＋造血干/祖细胞经14 d二步法定向分化后，总细胞呈悬浮培养状态(图5A)；总细胞经MGG复合染色后，普通光学显微镜下计数结果显示，巨噬细胞占总细胞的百分率约为50.0%(图5B)，经贴壁、纯化后，巨噬细胞占总细胞的百分率达91.0%(图5C)。由此成功获得人脐血CD34＋造血干/祖细胞来源巨噬细胞。
注释：人脐血CD34＋造血干/祖细胞来源巨噬细胞形态
(图5A：倒置相差显微镜下悬浮培养的巨噬细胞形态；图5B：普通光学显微镜下悬浮细胞MGG复合染色结果；图5C：普通光学显微镜下贴壁、纯化细胞MGG复合染色结果)
实验四：人白血病细胞系THP-1 诱导成巨噬细胞实验方案
1、实验Protocol
注释：THP-1 细胞系诱导分化成巨噬细胞
2、实验结果展示
（1）细胞形态及染色结果
THP-1细胞经佛波酯诱导处理后，从悬浮状态(图6A)变为贴壁状态(图6B)，此时获得的THP-1来源巨噬细胞处于M0型巨噬细胞，其具有单核巨噬细胞特性。普通光学显微镜下观察上述贴壁细胞的MGG复合染色结果显示(图6C)，细胞均为单核细胞，相比hPSC与AGM-S3基质细胞共培养来源与人脐血CD34＋造血干/祖细胞来源巨噬细胞，具有较大的细胞核，并且细胞核位于细胞中央，形态幼稚。
注释：(图6A：倒置相差显微镜下THP-1细胞形态；图6B：佛波酯刺激后，倒置相差显微镜下单核巨噬细胞形态；图6C：普通光学显微镜下单核巨噬细胞MGG复合染色结果)
（2）流式鉴定结果：分别对实验二/三/四样本进行流式鉴定
a：收集hPSC与AGM-S3基质细胞共培养来源巨噬细胞、人脐血CD34＋造血干/祖细胞来源巨噬细胞，由于巨噬细胞比其他髓系细胞更容易贴壁，通过贴壁培养、纯化巨噬细胞。将纯化后2种来源巨噬细胞与THP-1分化后巨噬细胞收集，采用兔血清封闭，孵育流式细胞术检测抗体，包括CD45-PE抗体、HLA-Ⅱ-FITC抗体、CD36-FITC抗体、CD11b-APC抗体、CD14-PE抗体、CD64-APC抗体、CD11c-APC抗体、CD68-PE抗体、CD86-APC抗体、CD206-APC抗体。通过FACScanton Ⅱ流式检测仪检测3种来源巨噬细胞表型分子表达情况，采用Flowjo10软件分析数据。
结果证明：均表达髓系细胞相关表型分子CD45、HLA-Ⅱ、CD36与CD11b(图7A)。另外，THP-1来源巨噬细胞还表达巨噬细胞相关分子CD64与CD11c，而hPSC与AGM-S3基质细胞共培养来源巨噬细胞与人脐血CD34＋造血干/祖细胞来源巨噬细胞，均高表达巨噬细胞相关表型分子CD14、CD64、CD11c、CD68、CD86、CD206(图7B)。
b：3种来源巨噬细胞表型分子CD14、CD64、CD68的流式细胞术检测结果显示，THP-1来源巨噬细胞缺失部分巨噬细胞相关表型分子表达，不能完全模拟体内巨噬细胞表型分子表达情况。
注释：不同来源巨噬细胞表型分子CD14、CD64、CD86通过流式细胞术检测结果(图8A～C：hPSC 与AGM-S3共培养来源巨噬细胞表型分子CD14、CD64、CD86表达情况；图8D～F：人脐血CD34＋细胞来源巨噬细胞表型分子CD14、CD64、CD86直方图表达情况；图8H～I：THP-1 细胞来源巨噬细胞表型分子CD14、CD64、CD86表达情况)。
综上，四种方法均可实现体外诱导巨噬细胞，通过不同来源巨噬细胞诱导分化方法的建立，或许可为探索早期自然免疫细胞的功能提供参考。
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