水质检测|新型检测方法定量盘法与平皿计数法检测水中菌落总数的比较
《净水技术》
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张颖，高杰
（国家城市供水水质监测网武汉监测站，湖北武汉 430000）
菌落总数是水体微生物污染程度的整体指示性指标，是评价水体卫生的重要指标，目前检测水中菌落总数的方法主要为平皿计数法，该方法即在需氧情况下，于37 ℃培养48 h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。该方法具有一定的局限性：对于厌氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，方法条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长；对于地表水等菌落总数较高的样品，检测需进行大量的稀释，人为误差较大；同时，该方法仅选取1 mL样品进行检测，对于部分清洁样品来说，取样量较少，样本的代表性相对不足。平皿计数法1985年开始使用至今已30余年，没有更新，美国环保局将酶底物法（Simplate法）检测水中菌落总数纳入EPA9215E中，广东省中山市供水有限公司率先引入该方法，并于2013年将其写入广东省地标。定量盘法（HPC for Quanti-Tray）是一种新型的水中菌落总数的测定方法，其原理与Simplate相近，是基于细菌特异性酶与底物反应后产生荧光的原理，培养48 h后，统计分析得到最终菌落总数，在不稀释的情况下，可以检测2 419 MPN/mL的菌落总数。本文采用平皿计数法和定量盘法两种方法，检测NSI质控菌株样品和武汉地区水中菌落总数，并将检测结果进行比较分析。
1 试验部分
1.1 主要试剂与设备
营养琼脂培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，HPC for Quanti-Tray试剂、97孔定量盘、NSI定量质控菌株等耗材由IDEXX公司提供。试验使用国产隔水式恒温培养箱，温控精度为±0.5 ℃，经计量部门校准合格。
1.2 试验步骤
（1）平皿计数法测定菌落总数参照《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12—2006）(1.1平皿计数法)进行。
（2）HPC for Quanti-Tray法：量取1 mL样品，加入99 mL无菌水中，充分混匀（或直接量取100 mL样品），加入HPC for Quanti-Tray试剂，用样品涡旋混合器涡旋震荡至完全溶解，倒入97孔定量盘，用程控定量封口机封口，放入培养箱中培养。
（3）NSI定量质控菌株（Lot Number:122117，031318-1）从-10 ℃冰箱取出，平衡温度10~15 min后，将质控菌株转移入预先准备好的100 mL无菌磷酸缓冲液中，轻轻振荡，待全部溶解后，在30 min内使用。
（4） 武汉地区实际样品为生活饮用水样品，参照《生活饮用水标准检验方法 水样的采集与保存》（GB/T 5750.2—2006）进行采集和样品保存，采样容器使用一次性无菌含硫代硫酸钠采样袋。
2 结果分析
2.1 NSI定量质控样品的检测分析
按照1.2节（3）的方法准备样品，然后分别按照1.2节（1）和（2）的方法检测低浓度、高浓度质控样品，结果如表1、表2所示。
表1 两种方法检测NSI定量低浓度质控样品的结果
注：NSI HPCQC Lot Number:122117，平皿法真值为（335±46）CFU/mL，可接受值为197~473 CFU/mL；NSI HPCQC Lot Number:122117，酶底物法真值为（341±43） MPN/mL，可接受值为197~473 MPN/mL
表2 两种方法检测NSI定量高浓度质控样品的结果
注：NSI HPCQC Lot Number: 031318-1，平皿法真值为（379±56）CFU/mL，可接受值为211~547 CFU/mL；NSI HPCQC Lot Number: 031318-1，酶底物法真值为（352±52）MPN/mL，可接受值为195~509 MPN/mL；三支质控溶解于100 mL缓冲液进行试验，平皿计数法将样品稀释十倍后检测
两种方法（图1）检测低浓度定量质控菌株的结果均值分别为314 CFU/mL和361.3 MPN/mL，结果均在定量质控菌株的不确定度范围内；检测高浓度定量质控菌株的结果均值分别为1136 CFU/mL和1093.9 MPN/mL，结果均在定量质控菌株的真值范围内。
图1 两种方法检测结果对比图片
2.2 实际样品的检测分析
（1）武汉地区45个管网水和出厂水样品，检测结果如表3所示。
两种方法对出场水和管网水的检测结果对比，可认为平皿计数法、定量盘法试验结果具有一致性，均可有效检测洁净水中的菌落总数。
表3 两种方法检测武汉地区管网水和出厂水的结果
（2）武汉地区30个出厂水加标样品，检测结果如表4所示。
表4 两种方法检测武汉地区出厂水加标的结果
运用软件Excel 2018，对平皿计数法、定量盘法检测结果进行配对t检验，为了使两组数据呈正态分布，现对数据进行对数处理后再进行t检验，结果如表5所示。
表5 两种方法检测武汉地区出厂水加标t检验结果
由表5可知， P=0.279（＞0.05），说明两组数据无统计学意义上的显著性差异，可认为平皿计数法、定量盘法试验结果具有可比性，均可有效检测水中菌落总数。
试验结果表明， 定量盘法在检测标准物质、实际水样、加标样品中菌落总数时，与平皿计数法作为对照，检测结果稳定、有效，可以作为检测水中菌落总数的新方法。
3 结论
（1）《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12—2006）规定，用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数，该方法自1985年使用至今已三十余年，没有更新；此方法存在很多不足，地表水等水源水检测需要的稀释倍数较大，结果读数耗时且人为误差较大，试验操作中培养基温度要求严格，因此平皿计数法不能满足实验室大量样本及应急检测的需水。定量盘法测定水中菌落总数，其检测结果与传统平板计数法无显著性差异。
（2）定量盘法测定水中菌落总数具有操作简便、结果容易读取、人为误差少、可以采用与总大肠菌群酶底物法检测同样的实验平台等优势，能满足实验室及现场检测水中菌落总数的要求，适合实验室大批量水样中微生物的检测，能提高生产力，同时该方法也适合环境应急突发事件中的现场检测。
（3）鉴于定量盘法测定水中菌落总数还未正式纳入相关水质标准中，且该方法所用试剂耗材价格相对较贵，定量盘法可作为平皿计数法检测菌落总数的验证手段。定量盘法在应急突发事件中现场检测方面有很大的应用前景，作为平皿计数法检测菌落总数的补充，将成为一种发展趋势，将来代替平皿计数法也未可知。