侯铁英|感染微生物的快速检测助力抗菌药物的合理应用
讲者：侯铁英（广东省人民医院）
整理：李良军（淮北市人民医院）
责编：王莉（武汉大学人民医院）、王超（江西省中西医结合医院）
来源：2020年SIFIC学术年会
目前临床细菌耐药问题日益突出，临床微生物学检测在感染性疾病的诊断和治疗中常常能起到决定性作用，因此，如何“快、准、省”的检测出感染微生物对于合理应用抗菌药物具有重大意义。本次年会由来自广东省人民医院检验科主任候铁英主任为我们详细阐述“传统”VS“现代”——浅谈多方法指导合理用药。
一、病原微生物培养
1、培养流程：标本采集——样本运输——标本接种——微生物培养——病原菌鉴定——病原菌药敏
2、培养流程存在的问题：
3、培养的优劣势：
二、涂片镜检
1、镜检流程：标本采集——标本运输——标本涂片——显微镜观察——最终报告。其中涂片质量和镜检质量是关键！
2、涂片镜检问题：
3、涂片镜检优劣势：
三、快速诊断：染色
1、染色的问题及优劣势：
①问题：染色目的、染色时间、冲洗脱落、假阴性…；
②优势：时间短、经济、特异性高、提示作用等；
③劣势：漏检、灵敏度差、主观性强等。
四、鉴定药敏
1、生化鉴定、鉴定卡、药敏卡、K-B法、E-test法、MIC法
2、鉴定是方向，药敏是核心要素
3、鉴定药敏的问题及优劣势：
①问题：鉴定偏主观、接种质量、体内外药敏差异、特殊药敏、结果解释、临床沟通等；
②优势：“金标”、指导用药、菌种收集等；③劣势：时间长、阳性率低、手工操作多、主观性等。鉴定药敏为临床提供依据。
五、“传统”微生物诊断技术存在的不足：
①敏感性较差，阳性率低；
②条件复杂、时间长；
③手工操作多、主观性强；
④漏检、误检、多检。随着科技发展，新的技术有效弥补了部分不足，形成优势互补，进而形成“现代”微生物诊断技术。
一、MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)
1、培养流程：标本采集——样本运输——标本接种——微生物培养——MS鉴定——病原菌药敏。MALDI-TOF MS 改善鉴定环节。
2、应用范围：
①细菌菌种；
②多血清型细菌；
③真菌；
④血、尿及无菌液体；
⑤粪便标本。
⑥局限性（部分报道）：1）1066株，84.1%鉴定到种，11.3%鉴定到属；2）1371株，93.2%鉴定到种，5.3%到属；3）80株非发酵菌，MS能鉴定67株（85.9%），9株鉴定错误，2株不能鉴定。生化鉴定和血清型鉴定仍是不可或缺的手段。
3、优劣势：
4、展望：
①完善菌株质谱图数据库；
②数据库多为国外资料，可能存在明显地理差异；
③尽快建立我国检验和鉴定的谱图数据库，增加数据库的种类和数量；
④灵敏度和准确性、分型鉴别及样品处理、质谱图采集和分析等需要研究和改进；
⑤标准化方面也需要深入探讨。
二、mNGS
1、宏基因组测序（mNGS）是综合分析来自患者样本的微生物和宿主的核酸物质的方法：①无需分离培养、纯化鉴定；②认识微生物数量和组成结构；③认识微生物的进化关系；④研究群落结构和功能的影响；⑤分析正常菌群和疾病下的结构和功能特征。
2、mNGS与“传统”技术：
3、mNGS与“传统”技术的互补：
①提示培养方向，提高培养阳性率；
②报告耐药基因，需药敏检测确证后，合理用药。
4、mNGS需要优化的方向：
①人源宿主：背景嘈杂——微生物含量极低；
②胞内菌（结核）/真菌：破壁难度高、检出率低；
③RNA病毒检测：易降解、检测难度大；
④比对准确度：数据库大小及质量影响比对。
三、多重PCR（Multi-PCR）
1、Multi-PCR是同时扩增多个核酸片段的PCR反应：
①高效性：同时检出多重病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型；
②系统性：成组病原体的检测；
③经济简便性：节省时间，节省试剂，节约经济开支。
2、系统组合：肝炎病毒感染、肠道致病性细菌、性病、需特殊培养的无芽孢厌氧菌、鉴定型别及突变、耐药基因检测。多重PCR高灵敏高特异性、检测周期短、但耐药基因仅有提示作用，基因型和表型不一致现象十分普遍。
3、Multi-PCR存在的问题与展望：
四、全自动医用PCR分析系统（GeneXpert）
1、GeneXpert是整合的微流体技术，实时荧光定量PCR的扩增和检测同时进行，具有很宽的光谱范围，主要应用于临床分子遗传领域、生物安全领域及生命科学领域。①无接触，消除污染；②完全内部质控；③超声裂解释放DNA；④流体学技术；⑤适于试剂成分的微量反应；⑥全自动的数据分析和结果解读。
2、快速、精准、稳定：①全自动的工作流程；②快速获得结果；③即时检测；④即插即用；⑤通过整合LIS系统即时获得结果；⑥支持多种样本类型；⑦可靠和可重复的流程；⑧结果的可信性；⑨污染可能性降至最低；⑩优化的故障处理。实现了样本进、结果出的全自动操作，应用前景大。
3、GeneXpert存在问题与展望：①潜力巨大，但目前可检测项目不多；②检测费用高，医疗负担大；③分子水平，存在基因与表型不符，需结合“传统”技术；④检测通量不高。
一、微生物诊断技术：GeneXpert、Multi-PCR、mNGS、培养、染色、涂片、生化鉴定、药敏、MS。
①“传统”和“现代”没有好坏之分，也无淘汰之说；
②每种方法都有其优劣势；
③多方法结合，才能提供精准治疗，助力抗感染；
④有些病原体仅需鉴定根据情况采取合适的鉴定方法；
⑤鉴定+药敏：快速诊断和治疗感染性疾病。
二、期待与展望：
①感染性疾病与多重耐药菌，精准诊断和精准治疗；
②多团队合作，多方位诊断共同提高诊断技能；
③诊断技术多而杂，各有优劣，选择合适的方法进行多面结合，助力临床诊断和用药。
可靠的微生物学检测结果可以指导临床诊断治疗，为临床科学用药和成功的感染控制提供依据，是合理使用抗菌药物、延缓细菌耐药、减少抗菌药物滥用以及监测医院感染的第一步，也是最重要的一步。多团队、多方位结合共同提高精准诊断，共同助力抗感染。