外泌体的心血管疾病治疗应用
几十年来，尽管有许多新的突破性的疗法发现，心血管疾病依然是世界上发病率和死亡率最高的首要因素。在过去的20年里，一些治疗干预措施已经得到了临床应用，包括基于细胞的治疗；然而，细胞移植在心脏组织缺血环境中的存活率和植入率低，这限制了它们的临床疗效。从机理上讲，细胞疗法观察到的功能改善的原因尚不清楚；然而，实验数据表明，它们可能通过旁分泌发挥作用，由外泌体（EVs）或其他因子介导。因此，目前人们对开发基于外泌体的无细胞疗法的兴趣与日俱增。
EVs是由脂质双层包围的细胞外结构，几乎所有已知的细胞类型都分泌。EVs包括两大类胞外体（exosome）和微泡（microvesicles）。胞外体（直径30-150nm）是由多囊胞内体的膜内陷形成的腔内囊泡，在多囊胞内体与细胞膜融合后释放到细胞外空间。微泡（直径50-1000nm）是一组高度异质的EV，其特征是通过质膜向外发芽，从而产生和分泌。
EV携带蛋白质、RNA和/或microRNAs（miRNAs）等分子，在细胞间通讯中起着载体的作用。大量证据表明，EVs参与许多生理和病理性心血管过程，包括血管生成的调节；血压控制；心肌细胞肥大凋亡和/或存活；以及心肌纤维化。由于EV普遍存在于体液中，如血液和尿液，EV已被用作心血管疾病的潜在生物标志物。此外，由于EVs是干细胞治疗的旁分泌效应的重要组成部分，EVs可作为心血管疾病的独立疗法。临床前研究已显示了EVs在保护心脏免受缺血损伤以及促血管生成等方面的治疗潜力。
大小：大小是用于对EVs进行分类的参数之一。一般来说，胞外体比微泡小，大小分布更均匀。EVs尺寸对于其研究和应用至关重要，因为大多数分离和鉴定的操作步骤都依赖于EVs的密度和直径大小。此外，EV的大小是由它们的发生途径所决定的，与EV的成分相关。最后，EVs的组织生物分布、细胞内化和细胞内转运的效率取决于大小。例如，在给药后大的（>200nm）和聚合的外泌体会停留在肺、肝和脾中，最后被巨噬细胞吞噬或者因无法渗透而与非血管的细胞和组织发生作用。
在细胞水平上，不同大小的颗粒可以诱发不同的摄取机制。例如，直径为100nm的颗粒可通过网格蛋白介导或细胞质膜微囊介导的内吞作用被吸收，而更大的聚集体更可能被导向溶酶体降解或膜再循环。因此，较小的囊泡可能往细胞内输送的效率更高。在心脏环境中，尤其是对于全身给药的EV，这一因素至关重要，因为EVs必须成功地渗入心脏组织，然后被相关细胞类型有效地吸收。
电荷：EVs的另一个重要特性是表面电荷。由于EV膜的一部分成分来自富含磷酸盐的质膜（剩余部分来自其他细胞器，包括高尔基体），因此EVs通常带净负电荷，细胞也是如此。然而，电荷也高度依赖于质膜的糖组成，而这又取决于内质网和高尔基体中唾液酸转移酶（将唾液酸转化为低聚糖的酶）的表达水平。表面电荷的变化可以用来推断EVs在悬浮状态下的稳定性，因为绝对值较低的话，可能会减少斥力而使EVs更容易聚集。EV的大小和表面电荷对于确定EV和许多潜在配体之间的相互作用机制以及靶细胞对它们的吸收至关重要。最后，EV样品中存在的污染物（如蛋白质或脂类聚集体）可能会影响各种功能和参数。考虑到这些污染物表面电荷的不均匀性，它们和EVs之间会形成聚集体。因此，必须遵循适宜的纯化方案。
膜的成分：胞外体膜的胆固醇含量比供体细胞膜高，这使它们不易受到小分子物质的渗透。此外，与供体细胞膜相比，胞外体膜含有较高水平的磷脂酰丝氨酸、鞘糖脂和鞘磷脂，而磷脂酰胆碱含量较低。与微泡相比，胞外体具有较低的蛋白脂质比。事实上，高胆固醇和鞘脂含量使得胞外体比微泡更耐洗涤剂和高温。胞外体除了具有脂类成分外，还被蛋白质和糖修饰，这些蛋白质和糖有助于胞外体的电荷和膜结构的维持，并介导胞外体与靶细胞之间的相互作用。例如，tetraspanins是一类膜蛋白，大量存在于胞外体中，其中一些（CD9、CD63和CD81）被认为是胞外体的一般标记物。从功能上讲，tetraspanins参与膜融合和细胞粘附，因此在胞外体内化中起着重要作用。其他种类的蛋白质，如趋化因子受体（例如，CXC趋化因子受体4）、粘附分子和蛋白多糖（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖），已被证明在介导EV与细胞表面的相互作用中起作用。当这些以蛋白质和糖为基础的成分被去除或掩盖时，EV内化和生物分布就会改变。EVs的跨膜蛋白与分泌细胞的结构相同，这就赋予了一定程度的细胞特性和可能的趋化性。
内含物：从20世纪90年代末开始，EVs被认为是细胞间通讯的重要介质，特别是在免疫应答和癌症方面。2007年发现胞外体含有miRNAs和其他类型的RNA，并能将其内含物转移到靶细胞，最终影响这些细胞的活性，这一概念在2007年得到进一步验证。采用高分辨率密度梯度分馏和直接免疫亲和分析的研究进一步剖析了EVs的成分。EVs在管腔中含有多种蛋白质和RNA，包括长的和小的非编码RNA、转移RNA和核糖体RNA。胞外体不含DNA，尽管由于与组蛋白共沉淀，DNA可能存在于较大的EV或富含胞外体的样本中。蛋白质可以通过翻译后修饰（如泛素化和糖基化）进入到EVs，并且这些途径可以用作携带靶向蛋白质进入EVs。对EV蛋白之间功能性建立的相互作用网络的研究表明，囊泡内的蛋白质高度有序地组成一个“纳米宇宙”，而不仅仅是一个无序的“胞内碎片”的集合。
第一项使用EVs作为心血管疾病的潜在治疗干预的研究，发表于2010年。在21世纪初，一些研究小组表明，移植不同类型的细胞，包括间充质干细胞和造血祖细胞或干细胞（CD34+细胞），可以改善心肌梗死（MI）后的心脏修复。随后，这些干细胞或祖细胞的积极作用被证明不是通过来自植入细胞的直接贡献，而是通过旁分泌因子，特别是由存活细胞分泌的EVs介导的。
自这些开创性研究以来，有几个研究小组已经证明了在MI、肢体缺血和慢性皮肤损伤的情况下，干细胞或祖细胞以及分化的体细胞分泌的EV的再生特性。一些研究已经在动脉粥样硬化性硬化和中风中进行，但是大多数关于EVs的心血管研究都与缺血性心脏病和MI有关。EV追踪研究表明，与冠状动脉内或静脉内给药相比，EVs心肌内给药可产生更高的EV在心脏内的滞留。目前收集到的临床前数据表明，无论其来源如何，EVs都能改善左室射血分数（比未治疗组增加1.3倍），并减少心肌梗死面积（与未治疗组相比减少3倍）。对EVs与供体细胞的治疗效果进行了评估，迄今收集的结果表明，在MI的情况下，EVs与供体细胞一样有效。
EVs在受体细胞中的治疗作用主要归因于蛋白质和/或非编码RNA，特别是miRNA的传递。例如，被认为参与胞外体的心血管保护作用的miRNA包括miRNA-19a-3p、miRNA-21、miRNA-22、miRNA-24、miRNA-29a、miRNA-126、miRNA-143、miRNA-146、miRNA-181b、miRNA-210、miRNA-222和miRNA-294-3p等。在以前的细胞治疗研究中，一些miRNA（包括miRNA-19、miRNA-21、miRNA-24和miRNA-210）已经被确认与心血管修复相关，而其他的miRNA则是新发现的。
与EVs生物活性相关的另一个重要成分是蛋白质，如血小板衍生生长因子D和pappalysin1。其中一些蛋白质位于EV表面，因此不需要传递到受体细胞的细胞质中。例如，pappalysin 1在心脏祖细胞的胞外体中高度表达，Pappalysin 1通过将胰岛素样生长因子结合蛋白4裂解为胰岛素样生长因子1（IGF-1)，进而激活IGF-1受体，导致AKT、ERK1和ERK2磷酸化以及随后caspase激活和心肌细胞凋亡的降低，从而介导来自心脏祖细胞的EVs的心脏保护和血管生成作用。
根据EV的来源和含量，它们可以触发各种心脏保护作用，例如通过调节自噬改善心肌细胞和内皮细胞存活；激活促生存信号通路（例如涉及AKT、ERK和Toll样受体的信号通路）和氧化应激水平的降低；通过影响免疫细胞极化（即诱导更具修复性的状态而不是炎症状态）和细胞因子分泌以及增加CD4+T细胞的活化来调节炎症反应；瘢痕含量减少；血管生成刺激。例如，心脏衍生的EVs通过miRNA-146改善了MI小鼠模型的心脏功能，减少了细胞凋亡和炎症反应，增加了心肌细胞增殖和血管生成。细胞外基质衍生的EV携带miRNA-199a-3p，通过调节转录因子GATA4的乙酰化，恢复了生物工程化心房的电功能。
上述研究强调了天然EVs在心血管治疗中的潜力。然而，它们的临床潜力尚未被认识到，在它们成为一种有效的治疗工具之前必须克服重要的局限性。这些限制可以通过使用生物工程技术来改善EVs的性能来解决。因此，为了提高天然EVs在治疗心血管疾病方面的疗效，人们开发了调节EVs并提高其生物活性、稳定性、靶向性和向心血管系统转送（通过开发EVs运载系统）的技术。
追踪：在体追踪EVs并跟踪其生物分布对评价其心血管治疗潜力具有重要意义。荧光，发光物，PET–MRI和SPECT成像技术已被用于体内监测EV，通常在分离EVs后会用化学配体修饰。虽然荧光和发光成像技术易于操作，但它们不能提供高灵敏度或绝对定量。相比之下，依赖于PET-MRI或SPECT-CT的方法提供了更高的灵敏度和绝对定量，也允许获取具有解剖细节的图像。一般来说，静脉注射从不同细胞源分离的标记EV（除了标记外没有进一步的修饰）不会导致心脏受损。然而，EVs在心脏的蓄积受输送途径、输送浓度和EV分泌细胞特性的影响。
生物活性：① 调节EV分泌细胞。EV分泌细胞可通过两种不同的程序进行调节：在应激诱导条件下（如低氧、血清饥饿或炎症）培养和转染外源化合物（如核酸，尤其是miRNAS23、miRNA拮抗剂、Y RNA、质粒DNA和小分子以增加其生物活性）。例如，从缺氧条件下培养的大鼠心脏祖细胞中收集的EVs与正常收集的EVs相比，增加了体外培养的心脏内皮细胞形成管状结构的能力，降低了体外培养的心脏成纤维细胞中促纤维化基因的表达，改善了梗死心脏的功能。此外，从转染miRNA-181a的人骨髓间充质干细胞收集的EV增加了外周血单个核细胞的修复状态，并且在心肌内注射到遭受缺血-再灌注损伤的小鼠心脏后，与基线相比，富含miRNA-181a的EVs增加了12%的左心室射血分数。
② EV分泌细胞也可以通过改变培养基来调节。例如，从内皮分化培养基中培养的人脂肪干细胞中收集的EV中miRNA-31水平增加。与在正常培养基中生长的脂肪源性干细胞收集的EVs相比，产生的EVs促进了内皮细胞的迁移、管腔的形成和主动脉环的生长。一些细胞平台已经被开发出来，用特定的蛋白质和RNA来定制EVs的富集；然而，这些平台还没有被评估用于心血管疾病应用。此外，很少有研究利用细胞机制来设计具有特定表位的ev，以靶向心脏。
③ 分离后修饰方法。使用细胞修饰机制来生产EVs的好处是保留了EVs的大部分生物物理特性，但也有缺点——在细胞中过度表达某个特定分子可能会对其生物学产生无法预料的后果，最终干扰EVs的生物发生。使用EVs分离后修饰的策略为EVs的有效生物工程装载、靶向和输送提供了替代方法，而不用考虑其来源细胞。然而，分离后修饰的方法可能掩盖或损害内源性EV特性，最终损害EV的生物活性。
膜渗透策略，如电穿孔、热休克或冻融程序、洗涤剂处理和超声波等，以加载外源材料，这些策略已经应用于EVs上，成功率参差不齐。其他策略包括被动加载，利用EV膜的疏水性将感兴趣的化合物被动地加载到EVs中，以及用胆固醇修饰感兴趣的分子。这些研究报告了高达70%的负载效率，但对EVs的生物物理特性的影响和确切的作用机制仍有待阐明。
使用转染剂或膜通透性策略对几种EV制剂进行了富集，并在心血管疾病的背景下对其进行了评估，以减少心脏纤维化、调节炎症反应和增加血管生成。例如，miRNA-21-5p在心肌梗死后纤维化的发展中起着至关重要的作用，它调节包括MMP2、PTEN和SMAD7在内的多个基因靶点。与使用未修饰的EVs相比，富含miRNA-21抑制剂的人外周血衍生EVs可减少MI小鼠模型的纤维化。在一项单独的研究中，从心脏祖细胞衍生细胞中收集EV，通过电穿孔法富含miRNA-322，并系统地注射到MI小鼠模型中，与未经修饰的EVs相比，可减少心肌梗死面积和纤维化，并增加血管生成。综上所述，这些研究证明了分离后富集EVs的可能性，从而提高了其与未修饰EVs相比的生物活性。
分布和生物靶向：在对动物模型进行全身给药后，EVs很快被清除或集中在肝脏、脾脏和肺脏中，EVs的半衰期（通常在分钟范围内）本质上取决于EVs分泌细胞的来源。EV的生物分布受多种因素的影响，包括给药途径和剂量。如之前在细胞疗法中观察到的，保留在多个器官中的EV可能会诱导全身性抗炎作用，提高心血管系统的再生能力。然而，研究清楚地表明EV疗效的提高与EV在病变区域的滞留有关。因此，人们开发了几种策略来控制EV的生物分布，并将EV靶向特定的器官和组织。
使EVs摄取量最大化的一个策略是增加其在循环中的稳定性，从而提高EVs与目标细胞或组织之间相互作用的可能性。用聚乙二醇修饰EVs增加了其循环时间并减少了非特异性细胞对其的吸收。另一种策略依赖于用特异性蛋白或肽对EV膜进行修饰，这些蛋白可以与心血管系统中表达的特定细胞受体或细胞外基质成分相互作用。一些例子包括靶向脑缺血区域的环肽（RGDyK）、靶向神经元的溶酶体相关膜糖蛋白2B（LAMP2B）–RVG结构物、靶向缺血心肌的CSTSMLKAC肽和靶向心肌细胞的WLSEAGPVVTVRALRGTGSW肽。Tetraspanins蛋白存在于EV膜中并且优先与特定细胞系结合（例如，Tetraspanins蛋白与内皮细胞表达的整合素α4β4链结合），但这些蛋白质可能不足以选择性和有效地将EVs靶向器官或组织。
在心脏病的病例中，临床前研究中已经报道了EVs的心肌内给药；然而，这种给药途径在临床上并不总是可取的，因为它涉及到导管插入术。静脉注射EVs是一个简单得多的程序，并允许重复应用；然而，这种方法更容易偏离靶点结合，增加不良反应的可能性。经过改造的EVs最终可能会克服这些障碍，将它们的治疗药物运送到受伤的心脏。有两种方法被用来修饰EVs的表面，使其靶向心脏。在一种方法中，对EV分泌细胞进行基因改造以表达肽，然后将其并入分泌的EVs膜中。例如，EV分泌细胞已经用慢病毒载体进行了基因修饰，该结构表达融合了肽（CSTSMLKAC）的膜蛋白（LAMP2B），从而靶向缺血心肌细胞。虽然没有EVs在心脏中积累的绝对定量，但荧光成像显示肽修饰的EVs比没有表面修饰的EVs积累的更多。
在另一种方法中，可通过两种主要策略对EVs表面进行化学修饰：将经蛋白质（例如链霉亲和素）或肽修饰的脂质物理结合到EVs的膜中，以及将连接物化学偶联于EVs表面的官能团（羧基或胺基）。这些反应可以在水溶液中进行，与传统的生物结合技术相比，具有快速、选择性和非常高效的特点。例如，心肌梗死后将经心肌靶向肽（CSTSMLKAC）修饰的EVs注射到小鼠，左心室射血分数增加了46%。
EVs分泌细胞的遗传修饰和化学方法修饰对EVs各有利弊。基因方法可能会产生一种更标准化的产品，这对于满足监管预期是可取的。然而，这种策略有一些局限性，包括由于基因操纵导致的EVs生物活性的变化，以及难以控制靶向表位的密度及其糖基化状态。化学方法可以允许有效地控制EV表面修饰的结构（包括防止肽降解的非天然氨基酸）和靶向表位的密度，而不考虑其来源细胞。另外，化学方法可以在EVs的纯化过程中进行，因此，其更适合临床应用。
摄取和细胞内转运：利用荧光成像技术和标记的EVs可以研究EVs的内化和细胞内运输。EVs的细胞内吞作用似乎受到EVs与细胞膜的相互作用以及受体细胞的内吞能力的影响。EVs的内化可以通过非特异性的相互作用，也可以通过特定的相互作用，如受体依赖性途径来介导。关于细胞内吞能力的差异、EV表面修饰对细胞内运输的影响以及EV表面修饰可能增加内溶酶体逃逸的影响，目前还知之甚少。然而，这些问题是至关重要的，因为大部分内化的EV在内溶酶体途径中被加工，最终在溶酶体中降解。实际上，大约60%的内化EV在与受体细胞接触48小时后定位于溶酶体。
有人提出了增加EVs内溶酶体逃逸的策略。在一种方法中，EVs被阳离子脂质和pH敏感的融合肽包被，这增加了内溶酶体膜的破坏，从而导致EV内容物的有效胞浆释放。在另一种方法中，EVs被精氨酸细胞渗透肽包裹，以诱导活跃的微胞饮作用，并更有效地将EVs释放到细胞浆中。
传送：在损伤部位局部给药EVs可增加靶向细胞和靶细胞摄取的可能性。已经开发了几种基于生物材料的策略从而在损伤部位持续释放EV，包括含有透明质酸、藻酸盐、壳聚糖、胶原或两亲性肽的水凝胶。水凝胶组合物的设计考虑了其生物学、降解、原位凝胶化特性、机械和EV释放特性。通过几种方法将EVs掺入水凝胶中。在一种方法中，EV与聚合物溶液混合而不涉及两个实体之间的反应。然后将溶液注入感兴趣的组织中，并在几分钟内通过分子间的相互作用、分子间离子相互作用或聚合物疏水链介导的自组装过程将聚合物物理交联，从而将EVs保留在聚合物结构内。
在另一种方法中，EV与聚合物溶液混合形成聚合物-EV共轭物并启动化学交联过程。然后将溶液注入感兴趣的组织，以进一步交联并形成水凝胶。在第三种方法中，EVs在聚合后被物理地并入水凝胶。与没有缓释系统的EVs相比，EV释放水凝胶增加了左室射血分数，缩小了梗死面积，减少了心律失常负担。例如，用含EVs的水凝胶贴片治疗的大鼠梗死心脏的左心室射血分数分别比不含EVs的对照组和单独接受EVs的对照组动物高40%和25%。重要的是，从水凝胶中释放EV的动力学似乎对其治疗效果有重要作用。例如，植入小鼠皮肤伤口的水凝胶缓慢释放EVs不如使用远程触发水凝胶在皮肤再生过程中协同释放EVs有效。在这项研究中，EVs被固定在一个水凝胶中，该水凝胶可以被暴露在蓝光下裂解。然后每隔一段时间将伤口暴露在蓝光下（这可以根据伤口的愈合率而改变），以触发部分水凝胶降解和EVs的控制释放。
在过去的十年里，在了解EVs的生物学特性及其在心血管领域的应用方面取得了重大进展。靶向技术可以增加EVs在心血管系统中的积累，从而减少所需的剂量，利用特定生物分子提高EVs含量的策略可能是其成功应用于临床的关键。EVs追踪技术的使用将提高我们对EVs生物分布机制的理解。此外，将外源分子加载到EVs上并控制其体内释放将为提高EVs的生物活性创造机会。最后，生物工程化的EVs将是一个极具前景的，不依赖细胞，耐用且可定制的治疗方法，以改善心血管疾病患者的结局。
参考文献：
Native and bioengineered extracellular vesicles for cardiovascular therapeutics. Nat Rev Cardiol. 2020 Jun 1.