这样的套路分析现在还能轻松5+分！
Cellular Heterogeneity Landscape in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma
喉鳞状细胞癌的细胞异质性
一、研究背景
喉鳞状细胞癌（LSCC）是呼吸系统的恶性肿瘤，在头颈部鳞癌（HNSCC）中死亡率和发病率最高，约60%的患者在诊断时已经患有晚期疾病。LSCC的主要治疗方法是手术、化疗和放疗，尽管在过去十年中治疗技术已有很大改善，但仍不尽人意，肿瘤异质性可能是无效治疗的重要原因，在细胞水平了解LSCC的组成和分子特征可能有助于解决此问题。在此之前，LSCC的分子研究仅停留在不同级别的肿瘤和正常组织的比较中，较少涉及肿瘤内的异质性。本研究中作者使用单细胞测序技术（scRNA-seq）进行研究，为深入理解LSCC肿瘤内异质性提供了基础。
二、分析流程
三、结果解读
1.LSCC组织的单细胞测序
两例中高分化LSCC样本来自两名未经临床治疗的男性患者（66岁和64岁），从右声带切除2cm3的肿瘤组织，一半进行scRNA-seq，一半处理为FFPE切片进行免疫组化（IHC）染色。p16INK4a染色结果显示两例样本均为HPV阴性。
scRNA-seq流程：
样本1使用BD Rhapsody平台进行测序。将组织消化为含有106个细胞的单细胞悬液，有效细胞获得率为82.33％。通过BD分选平台对每个细胞进行捕获，显微成像监测捕获效率，细胞保留率为89.50％，磁珠回收效率为87.70％。
对结合磁珠标签的RNA进行逆转录引入UMI，对cDNA进行随机引物PCR扩增构建文库，使用Illumina Hiseq平台进行测序，共分析了12,985个细胞，经过质量控制过滤后，鉴定出10,699个细胞，生成了来自32,290个不同基因的3,700万个不同的mRNA转录本（UMI计数），平均每个细胞有3,402个mRNA转录本（中位数2,223 UMI）和1,192个基因（中位数930）。
样本2使用Singleron GEXSCOPE微流控芯片进行测序，鉴定出3,712个细胞。
2.鉴定LSCC组织的细胞组成
使用Seurat包分析测序数据：预处理过滤基因数量少于200的细胞，选择前2500个高度可变的基因进行PCA主成分分析和t-SNE算法进行数据降维，评估前50个主成分进行两阶段的聚类。
图1a可以看到第一阶段中LSCC细胞稳健地分为五个簇，包括肿瘤细胞（54.00％），免疫细胞（占36.20％），上皮细胞（4.61％），成纤维细胞（3.42％）和内皮细胞（1.77％），可见肿瘤组织中免疫细胞占相当大的比例。
图1d热图显示簇中特定基因的表达，以鉴定相应的细胞类型。此外，在测序数据中几乎没有观察p16INK4a（CDKN2A）的表达（图3A），与IHC结果一致。
图1b,c显示第二阶段中免疫细胞和肿瘤细胞分别分为八个和五个簇，图1e,f热图显示簇中特定基因的表达。
免疫细胞包括T细胞（85.82％），巨噬细胞（7.52％）和B细胞（6.66％），其中T细胞中分为幼稚T细胞（36.34％），Treg细胞（23.80％），细胞毒性T细胞（23.55％），Th细胞（13.66％ ）和祖T细胞（2.65％），B细胞分为CD20+(MS4A1)B细胞（55.81％）和浆细胞（44.19％）。
肿瘤细胞包括永生肿瘤细胞（58.40％），增殖性肿瘤细胞（17.45％），转移肿瘤细胞（16.41％），角质形成细胞样肿瘤细胞（6.63％）和免疫肿瘤细胞（1.11％）。
使用Monocle R包进行伪时间分析，构建的单细胞轨迹见图1h，细胞状态主要分为三个阶段，左图展示不同肿瘤细胞簇的分布轨迹，右图从深到浅指示总体伪时间状态。
图1a-f：LSCC细胞在整体，免疫和癌症视野中的T-SNE图及基因表达特图。
图1g：LSCC组织的细胞组成
图1h：癌细胞簇的伪分化轨迹
3.基因功能富集和生存分析
接下来作者对每一细胞簇进行分析，通过Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达基因，按照logFC排序，选择top50的基因进一步进行GO、KEGG和Reactome功能富集，并且通过WGCNA鉴定共表达标志基因。对于肿瘤细胞簇的标志基因，使用TCGA数据库的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）样本进行了生存分析。通过分析配受体对列表，作者还探究了正常，肿瘤及免疫细胞之间的相互作用。以下为免疫及肿瘤细胞簇的详细结果。
4.免疫细胞的详细组成
图2a中突出显示了每个免疫细胞簇的t-SNE图，共表达标志基因和GO功能富集结果，包括生物学过程（BP），细胞成分（CC）和分子功能（MF）。图2b为正常，免疫和肿瘤细胞之间配受体对相互作用数的热图。
值得注意的是，样本中巨噬细胞高表达CXCL8且主要为M2型（标记CD163），并且在免疫细胞中，巨噬细胞与其他细胞（成纤维细胞，T细胞，肿瘤细胞和巨噬细胞自身等）之间的相互作用最为活跃。与作者先前的研究结果一致，HPV阴性HNSCC组织中多为M2巨噬细胞，可能通过高表达CXCL8影响免疫逃逸。
图2a：免疫细胞簇的t-SNE图，共表达标记基因和GO富集
图2b：正常，免疫和肿瘤细胞之间的配体-受体相互作用数热图
5.LSCC组织的肿瘤细胞异质性
图3a突出显示每个肿瘤细胞簇的t-SNE图，伪分化轨迹分布，共表达标记基因和GO功能富集结果。
角质形成细胞样肿瘤细胞高表达SPRR家族的SPRR3，SPRR1A和SPRR2A，编码角质形成细胞和鳞状上皮细胞分化的特异性标志物，差异表达基因也显著富集在与表皮细胞和角质形成细胞分化相关的功能和通路中。
增殖性肿瘤细胞特异性表达TPX2，CKS1B和MKI67，已有研究表明TPX2与高侵袭性的癌细胞有关，CKS1B在多种癌症中与细胞增殖和预后不良有关，MKI67则反映细胞的增殖状态，功能富集显示出与核分裂和染色体分离有关。
永生肿瘤细胞高表达标志物MTRNR2L1，MTRNR2L8和MTRNR2L12，而转移肿瘤细胞高表达SERPINB5，GJA1和TM4SF1，功能富集结果表明它们分别与受体拮抗剂活性和膜通透性调节相关。
免疫肿瘤细胞分散且数量很少，免疫相关基因如IL32，CD2和SRGN在该簇中高度表达，差异表达基因富集在淋巴细胞活化和细胞粘附的调节通路中。
伪分化轨迹表明，主轨迹分支有两个方向D1、D2，增殖性肿瘤细胞主要位于轨迹的起点，而永生肿瘤细胞和角质形成细胞样肿瘤细胞分别位于单独的D1、D2分支，转移肿瘤细胞则沿着起点到终点（D2）分布。
图3b显示了使用scran R分析得到的细胞周期阶段scran得分热图和每个阶段中的细胞比例。增殖性肿瘤细胞在G2 / M期的比例高于其他簇细胞，而角质形成细胞样肿瘤细胞大多在G1期。
图3：肿瘤细胞簇的t-SNE图，伪分化轨迹，共表达，GO富集和细胞周期分析结果
图4a,b：角质形成细胞样和增生性肿瘤细胞中标志基因的t-SNE图
对五个细胞簇标志基因的生存分析结果显示，以标志基因中位表达量分组的样本具有显著的组间生存差异，其中角质形成细胞样肿瘤细胞特异性表达的SPRR3，SPRR1A和SPRR2A与较好的预后有关，而增殖性肿瘤细胞特异性表达的TPX2，CKS1B和MKI67则与不良预后有关，其他三个细胞簇的标志基因均未显示出显著性。
作者还分析了这些标志基因与TCGA-LSCC肿瘤等级之间的相关性，结果显示增殖性细胞的标志基因MKI67，TPX2，TK1，CDCA3和HMGB1与肿瘤等级显著正相关，而SPRR家族基因与肿瘤等级呈负相关。
图4c,d：标志基因表达量分组的TCGA-HNSCC生存分析
图5a：标志基因与TCGA-LSCC肿瘤等级的相关性
6.LSCC组织中肿瘤细胞簇的空间位置
最后作者比较了HE染色、SPRR3蛋白和Ki67(MKI67)的IHC染色的结果，定位不同肿瘤细胞簇的位置。HE显示肿块可以划分为四个部分：角化珠（CP），肿瘤核心（TC，肿块的主体），边缘区（E，edge）和边沿（M，margin），肿块由肿瘤相关成纤维细胞形成的包膜包裹。
SPRR3蛋白在部分细胞的胞质和胞核中观察到强阳性染色，这些细胞的细胞直径约为27μm，细胞核直径约为8μm，大于E区域的细胞直径，仅分布在TC区域内且集中于CP周围。表明角化细胞样肿瘤细胞位于肿瘤中心，可能与细胞角质化有关，并可能进一步分化为CP的一部分。
Ki67(MKI67)染色呈阳性的细胞主要集中在E区域，以不同的细胞核直径（4-15μm）分散分布，表明这些增殖性肿瘤细胞位于肿瘤边缘，可能处于分裂阶段，与增殖有关。
以上，角质形成细胞样细胞和增殖性细胞在肿瘤组织中呈现出独特的空间位置，作者在图6中展示了肿瘤组织中所有细胞的空间分布模型。
图5b：LSCC组织中的HE染色，Ki67和SPRR3的IHC染色
图6：细胞的空间分布模型
小结
本文是通过scRNA-seq探索LSCC组织肿瘤内异质性的第一项研究，有助于后续研究进行预后标志物的鉴定和更全面地理解肿瘤异质性。通过t-SNE降维聚类和特征基因的分析，作者鉴定并验证了LSCC组织中的多个细胞簇，包括肿瘤细胞，免疫细胞，上皮细胞，成纤维细胞和内皮细胞，进一步的分析细致研究了肿瘤细胞内的异质性，定义了具有特定空间分布的角质形成细胞样肿瘤细胞和增殖性肿瘤细胞，功能富集分析、WGCNA和TCGA生存分析显示，这两类细胞与角质形成和恶性增殖有关，并且分别与较好及不良预后相关。