二代测序技术在结核性脑膜炎早期诊断中的意义
结核性脑膜炎 (Tuberculous meningitis， TBM) 是由结核分支杆菌引起的脑膜和脊髓膜的非化脓性炎症， 是中枢神经系统结核病最常见的形式。近年来我国结核性脑膜炎的发病率呈逐年升高趋势，由于其临床表现缺乏特异性， 且传统的病原学诊断方法耗时长、敏感度低， 临床往往难以做到早期确诊， 进而严重影响结核性脑膜炎的治疗及预后， 导致其致死、致残率居高不下，给社会带来了沉重的经济负担。
二代测序技术是一种新兴的检测病原体的方法， 但在结核性脑膜炎的诊断中仍缺乏临床应用实例，诊断价值不明确。通过对临床疑诊结核性脑膜炎患者脑脊液二代测序结果及临床资料进行分析， 从而评价脑脊液二代测序(next-generation sequencing， NGS) 在结核性脑膜炎诊断中的潜在应用价值。
本研究为回顾性病例分析研究， 收集2017年1月至2017年12月在神经内科确诊为结核性脑膜炎的7例患者。收集登记临床资料及实验室检查结果。所有患者及家属均签署知情同意书。诊断标准：①TBM评分系统评分大于12分，临床诊断结核性脑膜炎患者；②所有病例的血、CSF经一般的细菌、真菌、寄生虫或恶性肿瘤的细胞学检查结果均为阴性；③所有病例均经抗结核治疗而好转或痊愈。
1.2 研究方法
1.2.1 收集脑脊液
常规腰椎穿刺检查时额外留取1ml脑脊液，并在30 min内置于-80℃冰箱保存， 所有患者均签署知情同意书。
1.2.2 DNA提取
取300 μl脑脊液样本，使用DNA提取试剂盒 (TIANamp Micro DNA Kit) 提取DNA。
1.2.3 DNA文库构建与测序
提取的DNA经超声破碎至200～300 bp大小的片段， 使用BGISEQ-100测序平台 (中国华大基因) 构建DNA文库。应用Agilent 2100生物分析仪 (Agilent Technologies，美国Santa Clara公司) 质控文库插入片段大小， 使用定量PCR (赛默飞世尔科技公司) 质控DNA文库浓度。采用BGISEQ-100的测序平台 (天津华大研究所) 进行测序。
1.3 数据处理与分析
过滤掉低质量、低复杂度和长度<35bp的序列， 去除人的参考基因组序列， 所得的高质量测序数据与微生物基因组数据库 (ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih. gov/genomes/) 进行比对， 从而对微生物进行鉴定。微生物基因组数据库包含3 446种细菌， 1 515种病毒，206种真菌和140种寄生虫。通过Soap Coverage(http：//soap.genomics.org.cn/) 分析基因的深度及覆盖度等。
2.1 基线资料
7例患者中男性3例， 女性4例；年龄26～71岁；7例患者均为急性起病，伴有意识障碍6例， 伴有恶心、呕吐、乏力等结核中毒症状4例， 伴头痛症状者4例， 均伴有发热、颈强直；患者的一般临床资料及临床表现详见表1。影像学表现 (图1) ：急性脑梗死、柔脑膜强化。血培养及腰椎穿刺均在患者入院后1 d内进行， 7例患者脑脊液检查均提示白细胞计数增加[ (25～516) ×106/L]， 脑脊液生化提示7例患者脑脊液蛋白均有增高 (0.86～3.2g/L) ， 5例患者脑脊液葡萄糖降低葡萄糖 (0.96～1.81 mmol/L) ， 5例患者的颅内压压力升高 (210～420 mm H2O) ， 5例患者脑脊液细胞学提示以淋巴细胞为主的炎症， 常规、生化、培养、细胞学结果详见表2。此外， 7例患者脑脊液培养、脑脊液优生5项检查、隐球菌荚膜抗原测定、抗酸+革兰染色+墨汁染色、抗N-甲基-D-天冬氨酸受体抗体均为阴性。癫痫2例， 脑梗死4例， 陈旧性肺结核1例， 胸腔积液2例。
表1：7例结核性脑膜炎患者的一般临床资料
注：+：阳性症状/体征。
2.2 病原基因检测
对7例患者送检脑脊液均进行二代测序，排除背景序列， 脑脊液二代测序共检测到结核分支杆菌的核酸序列数1～42条，平均序列数12条。
2.3 治疗及转归
7例患者给予利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇四联抗结核方案治疗， 期间辅助以糖皮质激素消炎、营养神经、物理降温、保护脑细胞等对症支持治疗，疗程2个月。经抗结核治疗后， 患者头痛、发热、全身中毒症状消失， 脑膜刺激征转阴性， 治疗周期结束后复查脑脊液常规生化等化验结果基本恢复正常， 3例患者 (病例2、3、4) 影像学结果显示脑膜强化较前减少。
图1：7例结核性脑膜炎患者的头颅影像学结果
注：A (病例5) ：头颅MRI示右侧大脑脚、双侧放射冠、右侧基底节区急性脑梗死；B (病例3) ：头颅MRI示双侧基底节区脑梗死后出血；C (病例6) ：头颅MRI示双侧额叶、左侧枕叶、双侧脑室旁急性期梗死；D、E (病例4) ：头颅MRI示柔脑膜强化；F (病例2) ：头颅磁共振示小脑强化。
表 2：7例结核性脑膜炎患者的血液及脑脊液常规、生化、培养结果
注：+：表阳性检测结果；-：阴性检测结果；淋：以淋巴细胞为主的炎症， 中：以中性粒细胞为主的炎症。
结核性脑膜炎是常见的中枢神经系统感染性疾病， 致死率、致残率高， 早期诊断与治疗是提高疗效、改善患者预后的关键。然而，由于结核性脑膜炎的临床表现多不典型， 脑脊液中细菌负荷量过低， TBM的早期诊断常常具有挑战性， 并且常被误诊为隐球菌性脑膜炎、化脓性脑膜炎或病毒性脑膜炎。目前TBM诊断的金标准是脑脊液中检测到结核分支杆菌， 但是脑脊液涂片抗酸染色的阳性率仅为10%，而结核分支杆菌培养耗费时间较长， 通常需要2周以上时间， 而且培养的阳性率只有20%～30%，对于临床的早期诊断价值有限。
NGS是一种新兴的高通量测序方法， 可以快速的对DNA或者RNA样本的碱基进行测序， 目前已经被报道用于细菌、真菌、病毒等多种感染性疾病的诊断。但因测序数据判读无统一标准、质控方法的缺陷、缺乏高质量临床研究等不足，目前更多是作为传统检测方法的补充。
2016年Steven等首次使用NGS技术对大脑活检样本测序辅助诊断中枢神经系统结核病， 结核分支杆菌序列数15个，其后的病理学结果也验证了诊断。
2018年周晛等报道了NGS技术对活动性结核病中的诊断价值， 研究提示以临床诊断为金标准时传统检测方法 (结核分支杆菌培养或病理检查) 、Xpert MTB /RIF、NGS检测的敏感度分别为31.6%、37.5%和57.9%，特异度均为100%， 但是受样本量所限， 差异无统计学意义。
在本研究中， 7例结核性脑膜炎患者的结核分支杆菌培养及抗酸染色均为阴性， 2例患者的脑脊液细胞学提示以中性粒细胞为主的炎症， 至于培养阳性率过低可能与样本量过少及患者入院前已经在下级医院接受抗生素治疗所致。NGS检测到结核分支杆菌的核酸序列数1～42条，平均序列数12条， 序列数较低， 在检出结核分支杆菌的同时也检出了许多其他病原体的序列， 结合患者的脑脊液检测结果及临床表现考虑其他序列信息的出现为样品污染、背景噪音等因素干扰导致，最后的诊断性抗结核治疗也佐证了本研究的诊断。因此， 本研究认为二代测序在结核分支杆菌检测方面具有一定的优势， 即使在较低基因序列数的情况下， 也能够有效识别出细菌病原体。
脑脊液二代测序作为一种结核性脑膜炎的辅助诊断技术， 可以快速、灵敏地检测病原体，做到早期诊断、早期治疗， 提高结核性脑膜炎的预后。但在测序所得阳性序列数较低情况下， 如何与测序所得其他病原体相鉴别， 就需要医生结合患者的临床表现进行合理的判读。