科研 | PNAS：从幼苗到成熟期的转录组分析揭示田间干旱条件下高粱的生物代谢反应
干旱是限制作物产量最重要的环境压力。C4谷类高粱(Sorghumbicolor (L.)Moench是一种重要的粮食、饲料和新兴的生物能源作物，具有显著的耐旱能力。研究者进行了一项大规模的田间试验，在2个基因型高粱上施加了开花前和开花后的干旱胁迫，并严格分辨时间序列，从植株出芽到开花后，得到的数据集接近400个转录组。研究者观察到在叶和根组织中有一个快速和全局的转录组反应，具有明确的时间模式，包括调节已知的干旱途径。研究者还鉴定了核心光合作用和活性氧清除途径的基因型差异，强调了耐干旱和延缓衰老的可能机制——绿色表型的特征。最后，研究者发现丛枝菌根(AM)共生的关键基因表达大量缺失，并且植物根部有大量的真菌也相应减少。
论文ID
原名：Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals bioticand metabolic responses
译名：从幼苗到成熟期的转录组分析揭示田间干旱条件下高粱的生物代谢反应
期刊：PNAS
IF：9.58
发表时间：2019.12
通讯作者： Elizabeth Purdom
通讯作者单位：加州大学伯克利分校统计系
DOI号：www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1907500116
结果
研究者进行了一项大规模的田间试验，在17周的时间内，将高粱植株暴露在3种不同的浇水方案下。开花后干旱是指在9周(开花前)每周浇水后停止灌溉，导致开花后10到17周内植株暴露在干旱中(图1)。研究者对2个高粱基因型进行了试验：RTx430，这是一个耐开花前干旱和对开花后干旱敏感的基因型；和BTx642，一个stay-green的基因型，耐开花后干旱(有延迟叶片衰老的能力)，对开花前干旱敏感。这两个高粱品种都是光周期不敏感的，不表现出干旱逃逸(干旱下提前开花)。此外，在高粱中，耐旱性被定义为在干旱胁迫下表现出高产量，这两个品种在各自的干旱胁迫下都表现出了高产量。综上，这些因素确保了植物表现出耐旱性。在每个星期的抽样中，研究者选取三组实验重复，每组由10株植物组成。
图1 实验设计。A：对照(CON)、开花前干旱(PRE)和开花后干旱(POST)试验设计概述。所有标记为“已浇水”的样本在采集前5天进行灌溉。B-C：对照组(左)和开花前干旱组(右)第七周时的照片对照。D-E：RTx430 (D)和BTx642 (E)花后干旱3周后12周的田间图片，表明该stay-green品种衰老延缓。
对198个根和198个叶样本(共396个样本)进行配对RNA-Seq分析。每个样本单独比对，进行质量控制，并归一化。为了识别受干旱影响的基因，研究者首先将每个基因的表达建模为一个随时间变化的函数，并选择在对照组与干旱组处理之间表现出显著差异的基因。随后，研究者根据这些基因的表达模型，在组织(根和叶)和处理(开花前和开花后干旱胁迫)中对它们进行独立的聚类，并进行KEGG和GO分析。
总的来说，研究者的分析显示了对干旱的大规模转录反应。从开花前干旱恢复的植物在根和叶样品中表现出显著的表达变化。在开花前干旱期受影响的基因中，75%在复水后1周内恢复到与水分充足对照植株相似的表达水平。然而，大部分基因(2424个基因)在复水后仍有差异表达。这包括大量来自DNA复制途径的基因(特别是MCM 2,3,4,6和7的同源基因)，这些基因在开花前和开花后干旱期的叶片组织中强烈下调，在花前干旱恢复期间过表达(相对于对照组)(图2C)。综上所述，这些结果突出了田间种植高粱干旱和干旱恢复的时空间的复杂性。
根比叶表现出更强的转录中断
虽然叶片和根系样本都表现出对干旱的普遍响应，但研究者观察到，与叶片样本相比，根系样本不仅表现出更多的差异表达基因，而且表现出更大的基因表达的绝对变化(图2A)。这种表达差异在根和叶组织迅速明显，在干旱暴露的第1周，根的差异表达量是叶的2倍。在这两种干旱处理下，耐受性基因型(RTx430为开花前型，BTx642为开花后型)经过一周的干旱暴露后，叶片中差异表达的基因较少，而两种基因型在根中的转录变化数量差异不大。这些观察结果表明，尽管根系总体上受干旱的影响更大(可能是由于它在检测和吸收水分方面的作用)，但基因型对开花前和开花后干旱胁迫的适应性，可能主要取决于维持叶片的正常活动。
研究者观察到，在干旱条件下，根中下调的转录本多于上调的转录本(图2A)，研究者发现在这些下调的基因中有几个功能种类的富集，特别是大量的涉及植物防御的通路(例如:对真菌和病原体的反应)。在这些通路中，研究者观察到大部分WRKY转录因子(已知的调控，例如病原体防御反应)的表达在叶和根组织中被抑制(图2B)，而茉莉酸和水杨酸敏感基因在根中的表达明显下调。这一观察结果进一步支持所观察到的现象，即植物对生物环境的反应受到干旱的影响。
开花前干旱引起的时间变化比开花后干旱更复杂
与对照相比，研究者鉴定出的大多数对开花后干旱有响应的基因在干旱暴露的第1周表现出快速变化的表达模式，随后几周表达变化不大(图2G)。这种表达模式不同于对开花前干旱反应的基因，后者表现出多种特定于干旱的时间模式。例如，与水分充足的样品相比，在干旱条件下，一些花期前的花簇表现出相对稳定的基因表达(图2E)，而其他组的基因在干旱和对照中表现出不同的表达模式(图2F)。尽管在基因表达模式上存在着巨大的差异，在干旱条件下，研究者发现许多基因对开花前和开花后的干旱都有相同的反应(叶:41%；根:30%)。在两种干旱条件下表现出不同模式的基因中，最常见的模式是基因在一种干旱条件下表现出强烈的影响，而在另一种情况下只表现出很小或不存在的影响(根：2639个基因；叶：1155个基因)。例如，在根系样本中，WRKY转录因子在开花前干旱胁迫下表现出较强的抑制作用，但对花期后的干旱胁迫表现出较弱的敏感性(图2B)。在两种情况下(叶片51种，根235种)，一小部分基因表现出相反的调控模式。
图2 时间转录变化分析。A：在开花前干旱和浇水条件下，显著差异表达(DE)基因的柱状图，其表达量至少是2的log2倍。B： WRKY转录因子(TF)在干旱和浇水植物间平均每周表达变化的热图，显示了根中开花前(左)和开花后(右)干旱反应的特异性。C-D：干旱和浇水植物之间的对数倍表达变化(y轴)，每个基因随时间的平滑函数(x轴)。E-G：通过基因聚类发现的时间模式(temporal pattern)的例子。E：在开花前干旱(PRE)条件下，根系表达保持不变，而在浇水条件下，根系发育发生变化。F：开花前的干旱和浇水条件表现出时间上的变化。G：开花后的干旱(POST)初始表现出下降，而浇水后的表达则保持不变。
许多转录通路中的基因型存在巨大差异
为了更好地理解干旱适应策略的差异，研究者比较了基因型间的表达模式。从这一分析中，研究者确定了3977个基因(占表达基因的16%)以基因型特异性的方式受到干旱的显著影响。这些基因中约有25%在1个基因型中有差异表达。在这两种基因型中，其他基因也有类似的定性反应(qualitative response)，但程度不同(根据干旱情况和样本条件，在3977个基因中发现了30 - 50%的差异表达)。在基因型特异的干旱响应基因的注释功能中，研究者发现在莽草酸酯途径中有很高的基因表达，在干旱敏感的BTx642中，这些基因在开花前被强烈下调，而在耐旱的RTx430中则没有(图2D)。该途径产生的芳香氨基酸是多种对植物生长很重要的次生代谢物的重要前体，包括生长素和木质素。基因型之间的组成差异决定了植物对干旱的反应潜力，这可能对理解植物对干旱的不同反应具有重要意义。
Stay-green表型与光合作用和活性氧清除的差异有关
开花前和开花后的干旱影响许多参与光合作用的基因的表达。研究者观察到光合作用基因在两种基因型的叶片组织中具有相似的开花前干旱反应：在干旱周表达下调或不变，但在干旱恢复期表达急剧上调。开花前耐旱基因型RTx430在恢复期的光合基因表达量明显高于BTx642，与全叶绿素水平呈平行关系(图3D)。恢复期光合作用基因的上调可能是对干旱引起的发育迟缓的一种补偿性反应。更普遍的是，数据表明RTx430不仅在开花前干旱时期表现出更强的耐受性，而且在恢复浇水时恢复得更快。在开花后干旱条件下，光系统II (PSII) LHCB基因的同源基因Sobic.003G209800和Sobic.003G209900显著下调, RTx430比BTx642有更强的下调(图3A)。同样，在RTx430蛋白水平上，研究者观察到2个核心PSII亚基D1 (PsbA)和CP47 (PsbB)蛋白水平的降低，当水分含量为对照组的25 - 50%(图3B)。
图3 Stay-green表型、光合作用和干旱。A：2个LHC PSII基因(LHCBs)Sobic.003G209800和Sobic.003G209900)在干旱胁迫下，RTx430比BTx642表现出更强的下调作用。B：光合作用复合体代表亚基的免疫印迹分析。C：干旱条件下的叶片脯氨酸水平测定。D：三次HPLC测定总叶绿素水平(y轴)与周(x轴)的平均值显示了BTx642和RTx430之间的组成差异。E：叶提取物(y轴)在3个时间点(x轴)的GST酶活性。F：RTx430和BTx642在68个GST基因中组成基因表达值的差异。
限制活性氧的过量积累是耐旱性的重要组成部分。脯氨酸生物合成是ROS依赖过程和渗透保护的关键调控因子。研究者还观察到在干旱条件下，两种基因型的P5CS2 mRNA表达也有类似的增加。虽然基因表达结果支持了BTx642中脯氨酸生物合成能力的提高，但与RTx430相比，BTx642中干旱诱导的脯氨酸积累水平较低(图3C)，而且没有看到脯氨酸丰度的组成差异。这表明在开花后干旱条件下，BTx642在田间培养的ROS中，尽管脯氨酸的生物合成能力明显提高，脯氨酸作为渗透保护剂和调节剂的需求减少。
GSTs也是植物细胞ROS的关键调控因子，GSTs的表达受干旱诱导。研究者在对照条件下检测了两种基因型中相似的GST酶活性，观察到无论是开花前还是开花后干旱，RTx430中GST酶活性的增加都明显大于BTx642(图3E)。总体来看，脯氨酸水平降低，GST酶活性降低，LHCB基因表达升高和PSII蛋白水平升高等表现说明在开花后干旱期间，BTx642都指向较低水平的感知干旱诱导的ROS胁迫(图3)。
干旱破坏了AM真菌的共生关系
除了上述非生物胁迫反应，研究者还分析了干旱是否影响重要的生物相互作用，特别是高粱和AM真菌之间的共生关系。这种关系的核心是AM真菌将光合碳(photosynthetic carbon)转化为磷和其他矿物质营养素。AM真菌还可以改变植物的气孔导度，所有这些都能增强植物的耐旱性。在数据集中的干旱响应基因簇中，2个根簇(root cluster)被鉴定为高度富集(有69 - 75%的重叠)，这是之前鉴定为AM真菌在植物中定植标记的基因(图4A和B)。以前的研究结果表明，干旱导致半干旱草原的AM真菌生物量下降。研究者估计在开花前和开花后干旱期间AM真菌水平下降(图4 C和D)，这与AM共生诱导基因中观察到的mRNA表达下降有关，这些结果表明，干旱导致AM真菌丰度和这种重要的共生相互作用活性的降低。共生诱导基因包括与矿物质运输、光合作用、生物防御和根系发育相关的基因，特别是AM真菌传递的光合碳磷(Pi)和其他矿物质营养物质的交换是AM共生的核心。干旱条件下植物与AM真菌之间联系的减少表明了一种复杂的动态相互作用，这可能与光合产物的有效性降低、磷需求量减少或AM真菌的质量因严重缺水而下降有关。
图4 干旱条件下AM真菌与高粱的共生关系。A-B：在AM诱导基因(y轴)与week (x轴)高度重叠的集群中，花前干旱(PRE；A)和花期后干旱(花期后；B)的平均表达基因规模。C-D：AM真菌丰度与AM诱导基因表达的相关性，C为开花前干旱，D为开花后干旱。
除了上述与生物应激反应和代谢相关的基因簇外，与非生物应激相关的9个基因簇同样为高表达(图5A)。这些基因的预测功能包括热休克(如HSF和伴侣蛋白)、对脱落酸(ABA)的反应、对ROS/氧化应激和程序性细胞死亡。这些胁迫簇(stress cluster)内的基因对叶片和根组织的开花前和开花后的干旱都表现出显著的反应。在这两种情况下，这些基因的表达变化在干旱暴露的第一周都很明显。与AM基因簇相似，许多非生物胁迫簇基因也表现出与对照植物在开花前干旱恢复期相同的表达水平的延迟，尽管这两种基因型都表现出这种延迟。其他与胁迫相关的基因，包括4个假定的热休克蛋白(图5B)，在恢复期下调表达，而在开花前干旱周则显著上调表达。
除了这些应激簇基因外，研究者还发现了许多其他属于已知应激反应途径(如ABA信号转导和氧化应激)的基因，这些基因在开花前和开花后的干旱中都受到了强烈的下调。虽然研究者的讨论主要集中在那些与已知生物学功能具有同源性的基因上，但是大量差异表达的基因是完全没有特征的。其中，3923个没有注释，1870个与拟南芥没有同源基因。这是由于高粱基因组注释水平相对较低，高粱转录组有42.9%没有注释。这些基因对于高粱以及其他(更容易干旱的)品种的基因工程研究具有令人兴奋的潜力。
图5 应激信号和反应通路的时间表达。A和B：开花前干旱(A)和开花后干旱(B)下胁迫应答基因簇的表达模式图。C：4种热休克蛋白(HSP)在干旱条件下表现出较强的上调表达，在恢复期表现出较强的下调表达。
讨论
高粱目前已完成多个品种的重测序和全基因组测序，然而，这些调查仅限于温室研究(非田间样本)，并且绝大多数都只从叶子上取样。在本研究中，研究者对高粱进行了一项基于田间时序的转录组学研究。研究者每周从2个基因型(开花前耐旱型RTx430和留绿型BTx642)的叶片和根中取样近400个转录组，在控制浇水条件和2种不同干旱情况下进行分析。本转录组研究还跟踪了开花前干旱的恢复，即开花期后重新引入水分，以及开花后干旱的影响，即开花期后去除水分。这项对田间种植高粱进行的转录组研究，为研究农业相关环境下的耐旱性，以及土壤、根际和根微生物群落配对提供了宝贵的资源。研究者开展了一项全面的转录组学研究，分析了大田种植的高粱对干旱反应的分子基础。总的来说，研究者的数据表明高粱能快速检测并适应干旱胁迫。这种反应涉及转录组的巨大变化，影响了超过40%的所有表达基因，包括各种各样的分子机制。
每周对干旱高粱植株的取样显示了许多转录途径的动态特性。研究者强调了基因型之间的差异，特别是涉及到光合作用的基因，它们从再浇水后的开花前干旱中恢复的速度有多快。研究者同样观察到基因型间的组成差异可能会影响植物对开花前和开花后干旱的反应。最后，研究者描述了高粱和相关真菌之间重要的生物间相互作用，它们似乎受到了干旱的影响，减少了AM真菌的共生。这项研究的数据为未来高粱和其他作物的发展，以及对干旱的生物和代谢反应的研究提供了许多有影响的途径。这些数据的规模和范围为深入探讨抗旱性的分子机制，及其与植物生物环境的相互作用提供了前所未有的资源。