编译：罗睺，编辑：十九、江舜尧。
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导读
流感病毒是全世界发病率和死亡率的主要原因之一。然而，细胞内病毒复制的影响和不同细胞类型的宿主反应的变化仍然未得到详细描述。本文中，研究者使用单细胞RNA测序来研究肺组织细胞对体内流感感染反应的异质性。对同一单个细胞中病毒和宿主转录体的分析使研究者能够探究旁近细胞（暴露但未感染）与感染细胞相比的细胞异质性。尽管与上皮细胞相比病毒转录体负荷较低，所有主要的免疫细胞和非免疫细胞类型都表现出高感染率。结果显示所有细胞类型的反应主要是一个强大的通用转录反应，并且本研究揭示了流感感染的新特异性标记。这些发现为特异性针对感染细胞的靶向治疗开辟了新的途径。
原名：Dissection of Influenza Infection In Vivo by Single-Cell RNA Sequencing通讯作者：Ido Amit、Irit Gat-Viks作者单位：以色列特拉维夫大学生命科学学院细胞研究和免疫学系
应用宿主和病毒转录组联合单细胞定位技术分析体内流感感染
为了无偏见的同时研究流感病毒感染后的宿主和病毒转录状态，研究者使用流感感染2天后获得的小鼠（5.5-6.5周龄的雌性C57BL / 6J小鼠）肺细胞进行单细胞RNA测序。首先使用荧光活化细胞分选（FACS）分离免疫（CD45+）和非免疫（CD45-）来自流感处理和PBS（“对照”）处理小鼠肺的细胞。然后使用了大规模平行的单细胞RNA-seq方法，对所有聚腺苷酸mRNA进行了分析（图1）。分别从经流感处理的小鼠和对照小鼠中分析了2034和2146个细胞。为了评估数据的质量，研究者确定了与对照相比，从经流感处理的小鼠分离的细胞中差异表达的基因。结果这些基因在抗病毒相关的信号传导途径中被过度表达（如IFN信号传导和Irf7信号传导）。
图1 | 通过单细胞RNA测序鉴定的旁近细胞和感染细胞的综合流感感染图。
（A）实验工作流程的示意图。
（B）与九种主要细胞类型相关的单细胞转录特征。
（C）t-SNE图显示了单个细胞的细胞类型注释；
（D）细胞所属的小鼠；
（E）细胞内感染状态。
单细胞的聚集可区分不同的细胞类型。聚类注释结果：产生了9个较大的细胞簇，共有4064个细胞，包括非免疫细胞类型的来源：上皮细胞（EP）、淋巴管和血管内皮细胞（LEC和BEC）、成纤维细胞（FIB）和5种特殊的免疫细胞类型：粒细胞（GN）、Tcells、Bcells、NKcells和树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞的联合簇，统称为单核吞噬细胞系统（MPS）（图1B）。为了确定细胞是否确实通过细胞类型而不是通过处理或通过细胞内病毒基因转录而聚集，根据与先前分选的大细胞亚群的整体表达的最佳匹配对每个单个细胞进行注释。基于大量转录组数据的单个细胞的注释与基于标记的这些簇的注释一致。研究者进一步使用t-SNE将不同的细胞亚群投射到二维空间。正如预期的那样，具有相同细胞类型的细胞形成独立于处理（流感处理与对照）的单独tSNE簇（图1C和1D）。
由于病毒mRNA（vmRNA）已被聚腺苷酸化，因此MARS-seq可以捕获每个单个细胞内的病毒mRNA和宿主mRNA（图1 A）。研究者从与病毒片段对齐的唯一分子标识符（UMI）的数量推断出细胞内的病毒载量。具体而言，病毒载量定义为给定细胞的总UMI含量中病毒UMI（即与病毒片段之一对齐的UMI）的比例。因此定义了三类细胞：（1）“感染细胞”，其病毒载量高于某个选定的病毒载量临界值；（2）“旁近细胞”，即源自经流感处理的小鼠但未检测到表达任何vmRNA（病毒载量为零）的细胞；（3）“未暴露的细胞”，即从未感染过的对照小鼠衍生的细胞（图1A）。结果观察到，细胞分组正确地预测了高比例的真正感染细胞。
感染细胞的高流行是所有主要细胞类型的特征
首先探讨了九种主要细胞类型中每种细胞的感染率。研究者集中研究了携带至少0.05％病毒载量的受感染细胞。基于此临界值，研究者为每种细胞类型计算了来自流感处理小鼠的细胞中被感染细胞的百分比。有趣的是，在九种细胞类型的每一种中均观察到相对较大百分比的感染细胞，其中适应性免疫细胞的比例介于22％至31％之间，先天免疫细胞的比例介于25％至36％之间，非免疫细胞的比例介于32％至62％之间。在上皮细胞中观察到最高百分比的病毒感染细胞（62％）（图2 A和1 E）。
图2 | 病毒和宿主的联合单细胞分析揭示了在所有主要的肺源性细胞类型中感染细胞的高患病率。（A）在每种免疫和非免疫细胞类型中感染细胞的患病率。（C）在细胞类型特异性感染中分析I型IFN途径的潜在影响。显示的是Irf7野生型（x轴）相对于Irf7-KO小鼠（y轴）感染细胞的百分比。（D）经流感处理的宿主细胞内病毒载量的单细胞异质性。高预测感染率并不是由于技术上的人为因素造成的。首先，作者用流式细胞仪证实了感染细胞的高患病率。发现在感染的肺组织中NP阳性细胞的比例很高，相比之下，当细胞被胞外NP染色时，仅观察到2%的NP阳性细胞（图3b），表明被感染（NP阳性）细胞的高患病率不能归因于游离NP蛋白或NP-RNA复合物。其次，观察到少量的背景噪声：2075个未暴露细胞中只有25个（1.2%）被错误地归类为受感染细胞（图2A）。第三，真正的流感复制涉及从特定片段衍生的vmRNAs剪接亚型的产生。第四，UMIs与多聚腺苷酸化病毒RNA的3'端特异性对齐，发现细胞同时表达不同的病毒基因（图S1E），证实结果不是非特异性预测的结果。第五，VmRNA的检测在原理上可以被细胞的质量和复杂性所混淆。在所有主要细胞类型中发现感染细胞广泛存在，那不同细胞类型中感染细胞分数的差异（图2A）是否反映了真实的生物信号（而不是实验噪声）？为了解决这个问题，研究者对流感处理动物进行了第二次生物学重复实验。得到的结果是由相同的细胞类型群体组成，共有833个旁观者和402个感染细胞。重要的是，被感染细胞的细胞类型特异性百分比在两个生物学重复中可高度重现（图2b）。尤其是T细胞感染率最低，而上皮细胞感染率最高。非免疫细胞感染率普遍高于免疫细胞。值得注意的是，这些结果在感染后72小时检查的复制小鼠中是可重复的（原文图S4A），并且与以前的报告一致（原文图S4B）。由于所有的单细胞实验和计算程序都是独立地应用于每只小鼠的。因此结果表明，在不同细胞类型之间观察到的感染细胞分数差异反映了真正的细胞类型特异性。一种可能解释这种细胞类型特异性的机制是由主转录调节蛋白Irf7驱动的I型IFN信号传导。为了测试这种可能性，研究者在感染后48小时从经流感处理的Irf7-KO小鼠生成了肺组织的单细胞RNA-seq数据。有趣的是，尽管在Irf7-KO和WT小鼠之间观察到了IFN信号传导回路的主要差异（原文图 S1A ），但发现两种菌株中感染细胞的细胞类型组分之间具有良好的相关性（图2C）。总之，这些数据表明，所观察到的感染百分比差异是由一种或多种细胞类型固有特性引起的，而与I型IFN介导的宿主反应无关。感染的上皮细胞显示出普遍的细胞内病毒载量（而不是其他类型的细胞）接下来，研究集中于感染细胞亚群中病毒载量的组成。最近的一份报告描述了流感病毒在体外感染上皮细胞的过程中广泛的病毒载量。研究者想了解这种上皮细胞特性是否也适用于体内感染。为了解决这个问题，将感染细胞的组分为三类病毒载量状态：低（<0.5％），中（0.5％和5％之间）和高（> 5％）。结果发现上皮细胞表现出两个数量级的普遍病毒分布状态，33%、23%和44%的受感染上皮细胞分别以低、中、高病毒载量状态为特征（图2D）。上皮细胞和其他类型的细胞有明显的区别，通过观察感染的细胞（非上皮细胞）主要表现为病毒载量状态的低异质性：绝大多数（不同细胞类型中85%-100%的受感染细胞）维持低病毒载量状态，而高病毒载量状态仅由高达1.1%的细胞维持（图2）。表明至少在感染早期，上皮细胞的病毒载量异质性高于其他细胞类型。
研究表明，细胞对流感感染有很强的反应能力，涉及诱导多种干扰素应答基因。为了系统地表征这种反应，研究者分别针对九种细胞类型中的每一种计算了经流感处理的组织和对照组织的细胞群体之间的差异表达。发现共有450个基因差异表达（至少在一种细胞类型）。这些基因的聚类显示了一个由101个基因组成的通用模块，在流感感染期间几乎所有免疫和非免疫细胞类型都显示出一致的上调。（图3 A，B）。值得注意的是，该模块中的大多数基因代表已知的IFN刺激基因（例如，对于“IFNβ1”和“ IFNR”信号类别）和各种抗病毒药物的靶标转录因子如Irf7和Stat1，表明该模块是独立于细胞类型的一般I型IFN反应的一部分。研究者将此通用I型IFN模块称为“ IFN模块”。
（A）所有细胞类型的基因调控程序。在九种主要细胞类型（列）中，经流感处理和对照的小鼠（彩色条）的核编码（顶部）和线粒体DNA编码（底部）基因（行）的差异表达。仅显示了在至少一种细胞类型和21个线粒体基因中差异表达（DE）的450个核基因。右列表示四个I型IFN相关类别的成员。遗传标记的基因（“ IFN模块”，101个基因）以及普遍抑制的基因（“线粒体模块”，7个基因）标记在左侧。（B）显示了从对照（浅灰色）和经流感处理的小鼠（深色）衍生的细胞在每种细胞类型（x轴）中所选通用反应基因（子面板）的单细胞表达水平（y轴）的分布灰色）。（C）抗病毒细胞轨迹。图中所示为基因的IFN模块在单个细胞中的表达，这些细胞按照抗病毒轨迹（列）的位置排列。（D）与通用IFN和线粒体模块相反。每个细胞类型(颜色编码)中各模块(y轴)在抗病毒轨迹(x轴)上的表达如图所示。定义了IFN模块后，研究者能够表征每个单个细胞中的抗病毒应答。通过根据“抗病毒评分”（根据IFN模块中单个细胞的平均表达量计算）排列各个细胞的顺序，为每种细胞类型生成抗病毒进展轨迹。该轨迹显示出强烈的共调节细胞类型：与之相关的共表达的RANTI基因（图3c），轨迹显示细胞从稳态逐渐发展到抗病毒状态。与此一致，流感处理细胞比未暴露细胞更倾向于高抗病毒范围。为了验证抗病毒轨迹，使用流感处理Irf7 KO小鼠的单细胞RNA-seq数据。假设在没有Irf7的情况下，细胞会表现出抗病毒反应的受损轨迹。发现Irf7 KO样本中的细胞确实显示出对高抗病毒范围的明显偏向，但并没有发展到完全的抗病毒潜力。这表明这个轨迹确实反映了细胞通过抗病毒反应的进展。这种抗病毒轨迹的可塑性可能反映了可逆的调节变化。最近的研究表明，线粒体编码基因响应IFN和脂多糖处理。然而，这些发现在不同细胞类型中的普遍性及其与流感刺激的相关性仍然未知。有趣的是，对细胞类型的分析显示，几乎所有细胞类型中都有7个线粒体编码的基因持续受到抑制（图3A。“线粒体模块”）。首先，分析了肺部流感处理的大量数据，发现线粒体模块受到了抑制。其次，数据通过抗病毒细胞轨迹清楚地显示了干扰素和线粒体模块的负相关性（图3D）。进一步检查三种选定的细胞类型（粒细胞、T细胞和成纤维细胞）表明，约70%的表达基因通过抗病毒反应轨迹动态上调或下调。有趣的是，不同细胞类型的轨迹调控基因富含相同的潜在调控程序，尽管每个调控程序的特定靶基因在不同细胞类型之间存在显著差异。总的来说，数据提供了关于哪种基因在特定细胞类型的抗病毒轨迹上受到调控的全面信息。由于抗病毒动力学的细胞类型特异性目前只知道有限数量的基因，这种定位对于了解不同细胞类型中抗病毒反应进展的机制至关重要。感染细胞和旁近细胞中表达变化的高分辨率图可以传达有关宿主反应途径的有价值的信息。特别地，表达水平的差异可能受到细胞外暴露于感染性肺环境的影响，或者可能与细胞内病毒的入侵有关。先前的研究已经表征了许多在流感感染中起作用的信号级联，例如IFN和NF-κB信号，但每种刺激对宿主反应的贡献尚不清楚。研究者假设旁近细胞和未暴露细胞群体之间的差异表达将鉴定与暴露于细胞外环境信号有关的转录调控，因为这两个细胞亚群都缺乏细胞内宿主-病原体的接触。同样，受感染细胞和旁近细胞之间的差异表达可以确定与细胞内病毒感染相关的转录调控，因为这两个子集基本上都暴露于相同的细胞外信号。为简单起见，研究者将旁近细胞/未暴露细胞的差异表达称为“旁近反应”，将感染/旁近细胞的差异表达称为“感染反应”。在所有细胞类型中，通用IFN模块都显示出显著的旁近反应，表明通用的细胞外暴露效应相比之下，该模块的感染反应要小得多，并且在不同细胞类型之间观察或复制不一致（图4A-4C）。研究者对感染Irf7 KO小鼠的分析显示IFN模块的旁近反应显著降低（图4C和4D）。因此，IFN模块主要由细胞外暴露以依赖Irf7活性的方式调节。
图4 | 旁近细胞和感染细胞之间不同且共享的调节过程（A）检查旁近细胞和感染细胞中的I型干扰素（“ IFN”）和线粒体模块。（B）未暴露细胞（白色），旁近细胞（黄色）和感染细胞（棕色）中每个细胞（y轴）的基因平均表达量（表示为“ GEX”）。显示的是代表细胞类型的IFN模块（顶部）和线粒体模块（底部）的平均表达。（C）比较野生型（上）和Irf7-KO（下）小鼠中上皮细胞（y轴）和其他细胞类型（x轴）之间的基因应答。线粒体模块显示了细胞外暴露和细胞内感染的影响，除了显著的旁近反应外，还表现出显著的感染反应（图4A和4B）。在所有类型的细胞中，除了上皮细胞外，与未暴露细胞相比，旁近细胞中的线粒体模块通常下调，而受感染细胞群中的抑制作用进一步增强（如图4B）。Irf7的敲除效应消除了线粒体模块的旁近反应（如IFN模块的情况），但对其感染反应没有实质性影响（图4C和4D）。从概念上讲，这表明尽管病毒被维持在相对较低的病毒载量下，但仍可以通过不依赖Irf7的细胞内病毒传感器进行检测。此外，在异步调节的基础上，线粒体和IFN程序之间的不耦合：虽然IFN反应的峰值通常是在不存在细胞内浸润的情况下诱导的，但线粒体抑制峰值出现在细胞内流感病毒的存在下。尽管大多数细胞类型的旁近细胞表现出线粒体编码基因的显着下调，但上皮细胞的旁近细胞表现出相反的趋势（图4 D）。值得注意的是，细胞内感染逆转了上皮细胞特异性旁近反应（在整个中/低病毒载量范围内具有一致的结果），因此所有细胞类型都汇聚到相似的表达水平（图4 D）。尽管研究结果指出了作用于线粒体模块的两种不同的旁近机制（诱导上皮细胞和抑制其他细胞类型），但与Irf7-KO的发现进行比较表明，不同细胞类型的差异仅在于两个基础程序之间的平衡不同：（1）在上皮细胞中，Irf7-KO旁近细胞中野生型旁近细胞中线粒体模块的过度表达得以维持（甚至略微升高）（图4D），表明上皮细胞中的调节是通过不依赖Irf7的强激活和不依赖Irf7的弱抑制实现的。（2）在其余细胞类型中，野生型的旁近反应与抑制相关，而Irf7-KO的旁近反应显示出相反的效果（图4 C， D），与组合控制强Irf7介导的抑制和弱Irf7独立的激活。通过独立的生物学重复获得了相似的结果。总而言之，研究表明了作用于所有细胞类型的几种通用机制。IFN模块主要对所有细胞类型中主要由Irf7介导的细胞外暴露做出反应。相比之下，线粒体模块受三种不同的通用机制调控：（1）旁近细胞暴露导致Irf7介导的抑制作用（除上皮细胞外，所有细胞类型均受到强烈抑制）；（2）旁近细胞暴露导致不依赖Irf7的基因诱导（在上皮细胞中最强）；（3）在所有细胞类型中观察到的对细胞内病毒侵袭的普遍抑制。检查某些生物学过程是否显示细胞类型特异性效应。由于在单个细胞类型中检测单个基因的统计能力降低，研究者分析了三种细胞类型，其中以粒细胞、T细胞和成纤维细胞为代表的固有细胞、适应性细胞和非免疫细胞数量最多。在其中一种细胞类型中，共有234个基因在感染细胞和旁近细胞之间获得了显著的差异表达，表明与细胞内病毒感染相关的转录反应。为了验证这些识别基因，研究者进行了一个使用依赖性生物学重复的实验结果表明，候选基因与复制小鼠所鉴定的基因有明显的重叠。例如，在47只候选者的粒细胞中，17只（36%）在另一只小鼠中获得显著分数。两个重复之间的差异表达得分也有很强的相关性。因此，研究者将重点放在34个经验证的基因上（图5A）。对表达模式沿抗病毒轨迹的检测表明，所鉴定的靶主要由应答基因组成，在感染的细胞中具有较强的应答幅度(图5A和5B)。特别是，在34个基因中，24个(70%)的旁近细胞和感染反应遵循相同的方向(增强抑制或增强诱导)。因此，细胞内感染通常与细胞型特异性基因的反应高峰有关，而不管反应的方向如何。因此，细胞内感染通常与细胞类型特异基因的反应峰升高有关，而与反应的方向无关。这并不意外，因为通过Toll样受体3和RIG-I的细胞内病毒感应可能导致抗病毒反应增强。
（B）在特定细胞类型中表现出明显感染反应的代表性基因。在这项研究中，研究者使用聚腺苷酸mRNA的单细胞RNA测序来同时研究同一单个细胞中的病毒和宿主转录组。本研究中双重病毒-宿主scRNA-seq定位应广泛适用于多种病毒。特别是，定位是针对在细胞内复制过程中产生聚腺苷酸化mRNA的病毒而定制的。scRNA-seq对RNA基因组嵌入未聚腺苷酸化的游离病毒颗粒中的病毒特别有效。该方法应适用于多种医学上重要的负义单链RNA（ssRNA）病毒（例如RSV，流感，埃博拉和麻疹）和双链DNA病毒（例如疱疹病毒，腺病毒和痘病毒）。将单细胞转录组学数据与流式细胞仪或大规模细胞仪（CyTOF）测量相结合可以帮助确定细胞的感染状态。但不同病毒基因组片段的表达水平在细胞内可能有显着差异，这意味着尽管某些细胞大量表达了其他病毒基因，但某些细胞仍可能显示出较低的GFP水平。本研究发现上皮细胞确实显示出高病毒载量异质性，而其余细胞类型则保持低病毒载量状态（图2D）。值得注意的是，高vmRNA表达并不一定意味着高病毒后代，这可能是由于未能表达一个或多个病毒片段所致。上皮细胞被认为是流感病毒粒子后代的主要来源，但是相对于细胞内病毒载量状态而言，细胞内病毒侵袭的贡献尚未得到详细研究。本研究数据表明，与任何其他细胞类型相比，细胞内病毒状态是决定上皮细胞较高病毒后代的主要因素：此处发现高病毒载量的细胞比例是上皮细胞的30倍（图2 D），而被感染的上皮细胞比例仅约1.9倍（图2 A）。通过分析整个肺部所有细胞类型的流感病毒感染，研究者能够在所有经过流感处理的肺部所有丰富细胞类型中建立抗病毒诱导和线粒体抑制的一般原理。表明存在一种有效的抗病毒策略：I型IFN反应的激活提供了抗病毒防御机制。体内流感感染期间线粒体能量资源的抑制可能既有益（限制细胞内病毒复制）又有害（限制宿主快速反应）。因此，不同的细胞类型可能会在抗病毒反应和线粒体抑制之间保持适当的平衡。本研究数据表明：（1）通用IFN模块的异质性通常在旁近细胞中激发潜力（图4），并且在细胞内病毒入侵后，抗病毒程序以细胞类型特异性方式进行了微调（图5）；（2）线粒体一般性抑制高峰通常出现在受感染的细胞中，并且在没有细胞内病毒入侵的情况下，旁近细胞表现出线粒体编码基因的细胞类型特异性调控（上皮细胞上调，其余部分则下调）（图4）。在细胞内病毒入侵之后，当能量资源有限时，对宿主基因表达的实质性调节仅限于特定基因和细胞类型。上皮屏障暴露于入侵的病原体可能先于其他细胞类型。因此，上皮细胞维持抗病毒和促炎细胞因子大量分泌的能力对于有效和及时的宿主反应至关重要。本研究表明上皮细胞在表型上是不同的：旁近细胞上皮细胞显示出线粒体编码基因的大量诱导（图 4C和4D）。确定可以区分感染细胞和旁近细胞的特定细胞功能是至关重要的。本研究数据表明，线粒体功能性是一个有吸引力的目标，因为观察到在所有细胞类型中，线粒体模块在受感染的细胞中比在旁近血细胞中受到更强烈的抑制（图4 A）。此外在感染和旁近细胞中差异表达了与流动性和细胞外基质相关的基因（图5）。确定这种功能差异是否存在以及各种功能之间是否存在相互关系将需要进一步的实验。在此类实验中，病毒载量和功能特性都需要在单个细胞的分辨率下同时测量。将细胞功能与病毒载量状态联系起来的能力将有助于感染细胞特异性治疗策略的未来发展。在同一个细胞中同时定位宿主和病毒转录体为研究宿主病毒相互作用提供了一个框架。对体内流感感染的肺部细胞进行分析，揭示了一般和细胞类型特异性感染反应。通过分析旁邻细胞（暴露但未感染）和感染细胞的细胞异质性，研究者确定了流感感染者相对于旁邻细胞的特异性新标记。这些发现为专门针对感染细胞的靶向治疗开辟了新的途径。
