国人高分综述 | Theranostics：环状RNA-蛋白质相互作用：功能，机制和鉴定
编译：罗睺，编辑：十九、江舜尧。
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环状RNA（circRNA）是共价封闭的内源性RNA，无5'端帽或3'poly（A）尾。这些RNA以组织特异性，细胞特异性和发育阶段特异性模式表达。现在已知circRNA的生物发生受多种特定因素的调控。然而，以前认为circRNA是剪接错误的无关紧要的副产物。最近的研究证明了它们作为microRNA（miRNA）海绵以及蛋白质海绵，诱饵，支架和募集者的活性，有些circRNA甚至在多种病理生理过程中充当翻译模板。CircRNA将特定的蛋白质结合并隔离到适当的亚细胞位置，并且它们参与调节某些蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用。反过来，几种蛋白质在circRNA从生物发生到降解的生命周期中起着不可或缺的作用。然而，蛋白质和circRNA之间这些相互作用的确切机制仍然未知。本综述回顾了有关circRNA-蛋白质相互作用的当前知识以及用于鉴定和表征这些相互作用的方法。并总结了对这些相互作用潜在机制的新见解。
论文ID
原名：Circular RNA-protein interactions: functions, mechanisms, and identification
译名：环状RNA-蛋白质相互作用：功能，机制和鉴定
期刊：Theranostics（医学一区）
IF：8.063
发表时间：2020.02
通讯作者：Minsheng Chen Yuli Huang
通讯作者单位：南方医科大学，澳大利亚乔治全球健康研究所
DOI号：10.7150/thno.42174
介绍
环状RNA（circRNA）是共价封闭的内源性生物分子，没有5'端盖或3'poly（A）尾巴，这些RNA属于非编码RNA（ncRNA）。“circRNA”一词最早由Sanger及其同事于1976年提出，当时他们描述了“类病毒”的结构，该“类病毒”是具有感染力的单链共价闭合RNA分子，但后来人们认为这些分子是剪接错误的副产物，并且缺乏明显的生物学效应。最近，伴随着RNA测序技术和生物信息学方法的发展，科学家已经在真核生物中鉴定了数千种circRNA，包括真菌，原生生物，植物，蠕虫，鱼类，昆虫和哺乳动物，并发现这些RNA具有组织特异性，细胞特异性和发育阶段特异性表达形态，并且在物种之间是保守的。
众所周知，circRNA具有广泛的生物学功能，涉及到基因表达调控到蛋白质编码以及mRNA竞争。作为共价闭合的环状分子，circRNA比其他RNA更稳定。这种稳定性是至关重要的，可作为生物标志物。CircRNAs也证明是有用的分子作为用于多种疾病的治疗靶标，包括糖尿病，神经系统疾病，心血管疾病，慢性炎性疾病，和癌症。
尽管尚未确定circRNA的一般功能，但已描述了一些作用，这些作用由circRNA的子集共享，例如充当miRNA和蛋白海绵。CircRNA结合蛋白在调节circRNA合成和降解中起关键作用，并且circRNA -蛋白质相互作用已报道影响蛋白的表达、生物合成，和病理生理学过程。实际上，circRNA可以将蛋白质结合，存储，分类和隔离到特定的亚细胞位置。但是，circRNA与蛋白质和其他生物分子相互作用介导其作用的确切机制尚未完全阐明。
这篇综述的目的是概述circRNA-蛋白质相互作用的最新报道。本综述总结了关于circRNA的生物发生，生物学和功能的潜在机制的新见解，特别关注circRNA-蛋白质相互作用，并概述了研究这些circRNA-蛋白质相互作用的方法。
主要内容
丰富：大规模的RNA分析表明，大约75％的人类基因组可以转录为RNA 。在人脑中，有20％的基因产生circRNA，而在心脏中，只有约9％的表达基因产生circRNA。此外，由于circRNA的丰富程度与细胞类型有关，因此与肝脏的高增殖细胞相比，它们在低增殖细胞（如心肌细胞）中似乎具有更高的表达水平。在发育中的心脏，肺和脑组织中观察到的circRNA水平升高似乎主要是积累的结果。证据还表明，心脏和神经组织中存在与年龄相关的circRNA积累。circRNA在大脑中的年龄依赖性积累可能归因于这些分子的高度稳定性。它们对核酸外切酶的抗性使其中一些circRNA积累到相对较高的水平。大多数circRNA均由前体mRNA产生，前体mRNA也产生线性形式的RNA，其表达模式与其宿主mRNA的表达模式一致。尽管circRNA丰富，但与mRNA相比，它们通常以低水平表达。然而，一些研究报道环状RNA的表达与其同源线性mRNA的表达不相关。实际上，在某些情况下，circRNA的表达水平要高于其线性mRNA。
稳定性：尽管大多数circRNA存在于细胞质中，但由于它们缺乏自由端，因此它们非常稳定并且对RNase R和其他核酸外切酶具有抗性。因此，circRNA的半衰期比线性RNA的更长。circRNA在细胞中的平均半衰期超过48小时，而mRNA仅平均持续10小时。此功能使circRNA成为多种疾病（包括癌症）的生物标志物的理想选择。但是，circRNA可能仍然对许多其他RNase敏感，例如RNase A，RNase T1和RNase T2，这可能是circRNA降解的关键途径。有趣的是，一些circRNA被蛋白质介导的microRNA切割。例如，据报道，miR-671以Ago2切片机依赖性方式指导小脑变性相关蛋白1（CDR1）基因座的环状反义转录物的切割。除了其环状结构外，其他因素和机制也可能有助于circRNA的稳定性，但这些仍然很大程度上是未知的。
特异性：众多circRNAs表现出特异性的某些组织和发育周期。值得注意的是，circRNA在物种间进化上是保守的，存在于大多数生物中，包括古细菌，植物，酵母和大多数后生动物。人类成人和胎儿组织（心脏，肾脏，肝脏，肺，结肠和胃）的RNA测序表明，高达50％的circRNA是组织特异性的，并且胎儿组织中不同circRNA的数量和表达水平高于成人组织。CircRNA也对亚细胞位置具有特异性。外显子circRNA主要存在于细胞质中，而其他circRNA，例如环状内含子RNA（ciRNA）和外显子-内含子circRNA（EIciRNA）则富集在细胞核中。目前，人们认为circRNA是在细胞核中产生的，但仍不清楚如何将其运输到细胞质中。一些研究表明，circRNAs通过ATP依赖的RNA解旋酶以大小依赖的方式转运到细胞质中。N6-甲基腺苷（m6A）修饰也可能在circRNA运输中起作用。最新研究发现了m6A修饰的circRNA，circNSUN2，在结直肠癌患者中被上调，可以增强高迁移率的AT-钩蛋白2 mRNA的稳定性，从而促进结直肠癌的转移。此外，m6A修饰增加了circNSUN2向细胞质的输出。但细胞外运输的机制尚未完全了解。
翻译：尽管大多数circRNA均未翻译，但最近的一些研究证实某些circRNA可以翻译为蛋白质。例如，circ-FBXW7可以翻译成蛋白质FBXW7-185aa，但该蛋白质的功能仍然未知。
环状rna通常被认为来自于典型的剪接位点。当pre-mRNA处理事件减慢时，前体RNAs可以被导至促进反向剪接的替代路径。反向剪接的主要假设是，下游剪接供体位点和上游剪接受体位点侧翼的内含子序列循环使这些位点非常接近。反向剪接是circRNA的独特特征，在检测和分析circRNA的功能中很重要。不同的circRNA具有不同的连接，并且有三种circRNA环形成模型（图1 A）：（1）内含子配对，其中反向互补序列（例如ALU重复序列）（位于上游和下游内含子）提示剪接，使剪接供体位点和上游剪接受体位点非常接近，形成环。突变分析已经表明，约100个nt每个重复的足以用于外显子环化，即使当存在典型剪接和反向剪接之间的竞争。但是，内含重复序列并不总是足以触发反向剪接。（2）外显子跳跃和内含子套索形成，共价封闭的外显子circRNA的形成是通过将外显子的3'端（剪接供体位点）连接到同一外显子的5'端（单外显子circRNA）或与之连接而启动的。上游外显子（多个外显子circRNA）的序列。（3） RNA结合蛋白（RBP）介导的模型，其中某些反式激活活化剂RBP 与每个侧翼内含子特异性结合，形成一个桥，使剪接供体和受体位点足够靠近以形成环。替代剪接因子Quaking（QKI）与侧翼内含子结合并形成二聚体，从而使居中的剪接位点紧密靠近。但是，循环化的中间步骤仍然未知。
根据其结构域和生物发生特征，circRNA可以分为三种常见类型（图1 B）：（1）外显子circRNA（ecircRNA），主要存在于细胞质中；（2）环状内含子RNA（ciRNA），主要位于细胞核中；（3）外显子-内含子circRNA（EIciRNA），主要存在于细胞核中。EcircRNA似乎是最丰富的circRNA类型，占已知circRNA的80％以上。
除了充当miRNA海绵外，circRNA还有其他几种作用（图1 C-1）。通过增强与RNA聚合酶II（RNA Pol II）的结合，位于细胞核中的circRNA可以调节其宿主基因的转录。circRNA也可能与调节性RBP相互作用，包括通过其作为蛋白海绵，诱饵，支架和募集者的活性而相互作用，并进一步影响其靶mRNA的命运。此外，某些circRNA还包含内部核糖体进入位点，可以直接编码蛋白质。
circRNA-蛋白质相互作用
尽管circRNA的主要功能是通过其作为miRNA海绵的活性发挥作用，但其第二重要的功能是通过circRNA-蛋白质相互作用发挥作用。
与RNA分子相互作用的最著名的蛋白质是RBP。RBP是一类通过介导RNA的成熟，转运，定位和翻译而与RNA代谢过程相关的蛋白质，这些蛋白质甚至参与形成核糖核蛋白复合物。尽管circRNA序列的生物信息学分析已预测到RBP结合位点的富集很少，但许多circRNA预计会通过特异性结合位点与RBP相互作用。但是，最近的研究表明，RNA-RBP相互作用受RNA分子三级结构的影响很大。因此，circRNA的独特三级结构可能会对其蛋白质结合能力产生影响，其作用与传统的基于核苷酸序列的结合方式不同，使用哪种结合方式可能取决于具体情况。
circRNA与蛋白质的结合可能具有双向作用。已经报道了RNA-蛋白质相互作用影响蛋白质表达和功能，同时还调节circRNA的合成和降解。CircRNA可以作为蛋白质海绵或诱饵来影响其细胞功能，从而调节基因转录，抑制细胞周期进程，促进心脏衰老，诱导细胞凋亡以及促进增殖和细胞存活（表1）。这些功能将在下面进一步详细描述。
EIciRNA可通过与宿主U1 snRNP和RNA Pol II相互作用来减少其亲本基因的转录，从而与mRNA产生竞争，从而影响蛋白质翻译。同样，Abdelmohsen等报道了circRNA（circPABPN1）及其同源mRNA在RNA结合蛋白HuR之间的竞争，这影响了蛋白表达。另一项研究表明，circANRIL通过与人类血管平滑肌细胞和巨噬细胞中的60S核糖体组装必需因子Pescadillo homolog 1（PES1）结合，从而破坏rRNA的加工和核糖体功能，从而激活p53。这些结果表明，circRNAs还调节核糖体在蛋白质表达中的作用。
此外，circRNA可以影响正反馈回路中蛋白质的结合。Ashwal-Fluss等。结果表明，circ-Mbl包含MBL蛋白的多个结合位点，并通过MBL基因座本身的正反馈方式调节MBL表达。
合成: CircRNA由RNA Pol II转录并由剪接体生成，剪接体包括异质核核糖核蛋白（hnRNP），例如小的核糖核蛋白颗粒U1亚基70K和C（分别为snRNP-U1-70K和snRNP-U1-C），以及SR蛋白。CircRNA生物发生可能受到RBPs、转录因子以及顺式作用元件和反式作用剪接因子的共同调控（表2）。
首先，circRNA可以通过RNA Pol II与线性剪接竞争。RNA Pol II中增加剪接效率的突变产生的circRNA数量明显减少，这表明circRNA产生与线性剪接之间存在强烈竞争。在增殖细胞中，剪接效率应高于非增殖细胞，以满足细胞分裂和RNA合成的需要。因此，增殖细胞可能具有较低比例的circRNA，因为需要更多的线性RNA。但是，尚不清楚circRNA如何调节RNA Pol II。对于ElciRNA，2015年发表的一项研究表明，circEIF3J和circPAIP2与细胞核中的RNA Pol II和U1 snRNP相互作用，随后促进了其亲本基因的转录。此外，发现ci-ankrd52和ci-sirt-7与RNA Pol II延伸复合体相互作用，抑制这些circRNA会导致锚蛋白重复蛋白，锚蛋白重复域52（ANKRD52）和Sirtuin 7（ SIRT7）。因此，迄今为止所有证据表明RNA Pol II可以调节circRNA的生物合成。
其次，一系列研究表明，RBP可以调节不同系统和生物体中circRNA的环化。这些RBP包括作用于RNA的双链RNA（dsRNA）特异性腺苷脱氨酶（ADAR），QKI，FUS，核因子NF90 / NF110，DExH-box解旋酶9（DHX9），异质核糖核酸L（HNRNPL），RNA结合基序20（RBM20）的muscleblind蛋白（MBL）/脊椎动物同系物的muscleblind样蛋白1（MBNL1），上皮剪接调节蛋白1（ESRP1）和丝氨酸/精氨酸（SR）蛋白的富含。FUS与内含子结合，在反向剪接反应过程中位于反向剪接连接的侧面，这会影响鼠胚胎干细胞衍生的运动神经元中circRNA的表达。Ashwal-Fluss等是第一个根据带括号的外显子的环化率鉴定MBL蛋白参与外显子环化的方法。还表明了RBP QKI和RBM20可增加circRNA表达，甚至通过结合特定内含子基序从其他线性转录本诱导其形成。QKI与存在于两个内含子区域（靠近环化外显子）中的基序的结合可以促进RNA循环和通过蛋白质-蛋白质二聚化的反向剪接。Abdelmohsen等首次报道circPABPN1及其同源mRNA在RPB，Hu抗原R（HuR）中的竞争。另一方面，ADAR酶通过编辑内源dsRNA中的腺苷至肌苷来阻止先天免疫系统的激活，从而抑制了依赖反向重复序列之间碱基配对的circRNA的生物发生。因此，NF90 / NF110和HNRNPL / SRs在circRNA生物发生中以组合和协调的方式起作用。
值得注意的是，根据circRNA的类型，组织或细胞以及生物学环境，RBP对circRNA形成的调节作用差异很大。一个RBP可能对circRNA具有两种不同的作用，因为circRNA两侧的不同结合元件可以与RBP的不同功能域相互作用。RBP的表达也是时空特异性的，这有助于在不同病理生理情况下在不同细胞中circRNA的多样化表达。因此，RBPs可以作为circRNA形成的激活剂或抑制剂，因此，这些蛋白以不同的方式并通过多种机制调节circRNA的表达水平。
类似于mRNA，最近的研究表明circRNA也受转录因子的调节。例如，c-Myb的和TWIST1（碱性螺旋-环-螺旋转录因子）可以结合到分别circHIPK3和CUL2 circRNA，的启动子，和上调其表达；Cul2启动子激活后，Cul2 pre-mRNA和circRNA的水平增加，而Cul2 mRNA和蛋白质的水平出乎意料地降低。但是，与circRNA共享同一启动子的mRNA的命运是未知的。有必要进行进一步的研究以探索所涉及的潜在机制。
降解：CircRNA不受许多典型的RNA降解途径的影响。目前，关于circRNAs如何在体内降解的机制知之甚少。从理论上讲，circRNA的降解可以通过核酸内切酶然后结合核酸外切酶和核酸内切酶来引发。目前，关于circRNA 在体内降解的机理和速率知之甚少。通过核酸内切酶活天然circRNA降解的第一个证据，发现在体外使用RNA酶H和Rrp44。然而，circRNAs也显示出可在体外有效地被基于人工shRNA / siRNA的系统降解。最近，RNA修饰，m6A，以及聚（I：C）刺激示于激活所述内切核糖核酸酶，RNA酶L，和在circRNAs的降解中发挥作用。有趣的是，最近发现了其他降解模型。例如，在正常条件下，circPOLR2A与双链RNA（dsRNA）激活的蛋白激酶（PKR）结合，而在病毒感染的情况下，PKR被激活并从circRNA释放，从而使RNase L识别并降解该蛋白。GW182蛋白由Ago结合域（ABD），泛素相关域（UBA），富含谷氨酰胺的域（Q-rich），中间区（Mid）和RNA识别基序（RRM）组成）和C末端区域（C-term），也参与了从果蝇到人类的许多circRNA的降解。尽管不是必须的，但这些特定结构域可以加速circRNA降解。除降解外，还可通过胞吐作用或外泌体的活性从细胞中消除circRNA。
RNA通常以与DNA-蛋白质相互作用相似的方式通过静电相互作用，氢键，疏水相互作用和碱基堆积与蛋白质相互作用。根据生物信息学分析，预计许多circRNA都具有RNA结合蛋白位点（图2 A）。自2013年以来，大量报道了circRNA与蛋白质结合并起蛋白质海绵的作用，类似于已知的miRNA海绵活性。
2014年，Ashwal-Fluss等人证明circ-Mbl包含MBL蛋白的几个结合位点，从而调节circ-Mbl和MBL生物发生。从那时起，一系列研究证明了这一概念，特别是对于RBPs，包括ADAR，QKI，FUS，NF90 / NF110，DHX9，HNRNPL，RBM20，ESRP1和SR蛋白，均已提出含有结合基序的提议。对应的circRNA。RBP也可以具有多个靶RNA。Schneider等发现34个circRNA与IMP3（IGF2BP3，胰岛素样生长因子2-结合蛋白3）有关。RBP包含各种结构基序，例如RNA识别基序（RRM），dsRNA结合结构域，锌指结构域和其他结构，并且其中一些可能与circRNA结合有关。
最近，有研究表明circ-Amotl1与PDK1和AKT1结合，然后鉴定出假定的PDK1和AKT1结合位点。这些分子的结合导致AKT1磷酸化和核易位，而与circ-Amotl1互补的寡核苷酸可以逆转外源circAmotl1的作用。
用于探索蛋白质-circRNA结合机理的现有方法分为两类：预测蛋白质上circRNA结合位点或预测circRNA上蛋白质结合位点。由于关于circRNA序列的信息有限，因此沿着circRNA链预测蛋白质结合位点是比较困难的方法。蛋白质-RNA结合位点的预测本质上是一个分类问题，涉及序列的唯一表示形式和分类模型。理论的基础是ķ元组核苷酸组合物，其主要是基于A（腺嘌呤），G（鸟嘌呤），C（胞嘧啶），和U（尿嘧啶）碱基比例。有许多基于此理论的有用数据库来预测和探索RNA蛋白质相互作用的作用，例如CircInteractome（Circular RNA Interactome，https：//circinteractome.nia.nih.gov/index.html）。
Zhang及其同事发现，某些RBP的circRNA结合位点表现出共同的模式，例如在包括Argonaute 2（Ago2），α-酮戊二酸依赖性双加氧酶alkB同源物5（ALKBH5），细胞在内的几种RBP中常见的“ GAAGAAG”基序。周期相关蛋白1（CAPRIN1），lin-28同系物B（LIN28B）和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3（IGF2BP3）。尽管有这些共同的基元，但对于相同的RBP，circRNA和线性RNA上的结合位点可能具有较大的序列多样性。有趣的是，当FUS与circRNA结合时，RBP结合的特异性变得比线性RNA更高。
基于结合位点的circRNA-蛋白质相互作用理论不能解释迄今为止观察到的所有相互作用。报告显示，没有任何预测结合位点的circRNA也具有与蛋白质相互作用的能力。越来越多的研究揭示了某些蛋白能够结合不同circRNAs，而几个circRNAs也可以动态地结合不同的蛋白质。似乎circRNA的三级结构可能会导致这些相互作用。实际上，已知蛋白质与其他类型RNA的相互作用受RNA分子三级结构的影响很大。circRNA的独特三级结构可能需要比以前认为的更为复杂的蛋白质结合过程，因此需要进一步的研究来揭示其确切机制。
已证明Circ-Foxo3与不同细胞中不同条件下的多种蛋白质结合（图2 B）。例如，circ-Foxo3与抗应激蛋白ID-1，抗应激蛋白FAK，HIF-1a和转录因子E2F1相互作用，从而将这些蛋白保留在细胞质中并导致细胞衰老。这种circRNA还增强了细胞质中p21和Cdk2之间的相互作用，从而阻止了Cdk2与细胞周期蛋白A和E的相互作用，从而阻止了细胞周期进程。Du及其同事得出结论，由于细胞环境中的因素（例如溶剂和金属离子）对circRNA的动态三级结构具有强大的影响，因此circRNA的三级结构在各种细胞系，组织和发育阶段可能会有所不同。因此，这些circRNA通过与不同的功能蛋白结合，可以在不同的组织或发育阶段表现出多种不同的功能。但是，这种结构流动性的程度尚未被揭示或直接证明，并且进一步，还需要深入的研究。
最近研究发现了更多的细节问题（图2 C-D）。CircANRIL似乎形成了一个模仿rRNA的茎环结构并与PES1结合，从而阻止了它与PeBoW复合物（Pes1，Bop1和WDR12）的相互作用，后者是60S核糖体亚基生物合成的关键调节剂。此外，2019年的一项研究表明，内源性circRNA（circPOLR2A）倾向于形成16-26 bp的不完全碱基配对的RNA双链体，从而抑制双链RNA（dsRNA）激活的蛋白激酶（PKR）在先天免疫中的功能。该研究进一步证实了缺少dsRNA内区域的circSMARCA5的过表达在聚（I：C）处理后不会抑制PKR激活（circRNA抑制PKR活性取决于其dsRNA介导的激活）。这些结果表明，circRNA的三级结构确实起着极其重要的作用。但是，提出了进一步的问题。在体外观察circRNA 时，它们的三级结构可能会发生变化，但是目前尚无可用的方法来揭示它们的原位动态相互作用。此外，由于circRNA稳定且保守，因此三级结构的变形将更加困难。因此，circRNA如何与诱饵和支架等不同蛋白质结合？circRNAs的研究领域仍处于起步阶段，还有更多工作要做，还有令人兴奋的发现。
即使大多数circRNA不包含多个蛋白质结合位点，许多circRNA仍可以有效地充当蛋白质海绵。例如，QKI与形成circRNA的外显子侧翼的位点结合，从而在上皮-间质转化（EMT）期间调节circRNA的形成，并且将QKI结合位点插入线性RNA可以诱导外显子环化。另外，circ-Amotl1通过结合位点与PDK1和AKT1结合，以介导伤口修复（图1 D）。
circRNA在其作为蛋白质诱饵的功能中，与靶蛋白在适当的细胞部位协同作用，以改变蛋白质的常规生理功能。例如，circ-Amotl1能够结合并保留c-Myc在细胞核中，从而稳定c-Myc，上调其靶基因并导致细胞增殖增加，细胞凋亡减少和高度致瘤性表型。此外，内含子套索可充当细胞质中TDP43（TAR-DNA结合蛋白43）的诱饵/池。建议CircPABPN1螯合HuR，从而充当HuR的诱饵并损害PABPN1翻译。CircPOLR2A和circDHX34可以作为病毒感染前正常细胞中NF90和/或NF110的分子储存库。因此，不同的circRNA能够结合各种组织中和各种情况下的不同蛋白质。唯一的共同特征是RNA具有与蛋白质特异性相互作用且具有高亲和力的能力，这表明大多数circRNA在对其靶蛋白的正常生理作用方面可能起拮抗作用，并且这些RNA可能包含另一种形式的压力条件下的自我调节（图1 E）。
CircRNA还可以充当支架，促进两个或多个蛋白质之间的接触。某些circRNA，例如circ-Amotl1和circ-Foxo3，起蛋白质支架的作用，以促进酶及其底物的共定位。发现Circ-Amotl1在与PDK1和AKT1相互作用期间起着支架的作用，以促进它们的核易位，这对于细胞增殖和存活很重要。在Du等人的研究中，观察到circ-Foxo3充当多种蛋白质的支架。例如，circ-Foxo3可以与p53和E3泛素蛋白连接酶Mdm2结合，从而促进Mdm2诱导的泛素化和随后p53的降解（图1 F）。
蛋白质募集
circRNA还可将特定蛋白质募集到某些细胞位置，例如circRNA FECR1，它将10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶1（TET1）募集到其宿主基因FLI1的启动子区域，从而导致CpG位点和主动转录。此外，circ-Amotl1从细胞质募集信号转导和转录激活因子3（STAT3）到细胞核，并稳定其与Dnmt3a启动子的结合，而circMYBL2通过调节FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）的翻译。募集聚嘧啶束缚结合蛋白1（PTBP1）在急性髓细胞性白血病进展过程中促进FLT3基因的内部串联复制（图1 G）。
翻译
最初认为CircRNA是不可翻译的。但是，circRNA大多是胞质的，起源于蛋白质编码外显子，引起了人们是否可以将其装载到核糖体上并翻译成蛋白质的问题。研究证明circRNAs在体外和体内均可以被翻译（图1 ħ）。研究了许多经过深入研究的蛋白质编码circRNA：circ-ZNF609，circ-FBXW7，circSHPRH，cirPINTexon2，circMbl和最近报道的circ-AKT3（表3）。这些研究表明，内部核糖体进入位点（IRES）和开放阅读框（ORF）是用于circRNA蛋白质翻译必要的部件。此外，N6-甲基腺苷是RNA的最丰富的碱基修饰，可以促进人类细胞中circRNA的蛋白质翻译的有效启动。
一些特定的circRNA也与核糖体的翻译有关，涉及不依赖于帽的翻译。核糖-circRNA（cUTR）的非翻译区允许在体外和体内进行不依赖帽的翻译，这与IRES序列无关。此外，在4E-BP和FOXO中存在特定序列可以通过circMbl cUTR增强它们的翻译。
circRNA编码的微蛋白相对较短，长度约为146-344个氨基酸。在代谢活性细胞（例如癌细胞或成肌细胞）中发现了所有circRNA编码的蛋白（表3），这表明circRNA的翻译是一种应急措施或补充，可以满足这些细胞的额外需求；翻译的蛋白质在此类细胞中也可能具有某些功能。尽管大多数蛋白质的生理功能尚未确定，但很可能它们具有由转录本的线性形式编码的全长蛋白质对应物的某些功能。例如，circ-FBXW7编码微蛋白FBXW7-185aa，它与FBXW7竞争以结合USP28（c-Myc降解的抑制剂）来促进c-Myc降解。但是，关于circRNA的这一方面仍然有许多未解决的问题和许多争论。例如，哪些circRNAs被翻译以及这些circRNAs被翻译的环境仍不清楚。
目前，circRNA和蛋白质之间的相互作用主要通过RNA下拉分析或RNA免疫沉淀（RIP）进行分析。circRNA的全基因组分析，基因座特异性分析和可视化也可用于发现，分析和了解circRNA的生物发生和功能。
RNase保护测定（RPA）
RPA是检测细胞提取物中RNA和RNA片段的实用方法。不同的RNA酶具有相应的RNA底物；因此，可以连续纯化目标RNA，从而获得目标circRNA。通过使用相应的RNA酶或PCR 排除rRNA，tRNA，poly（A）+ RNA和线性RNA，可以丰富CircRNA 。候选circRNA的圆形性质可以通过用RNase R处理总RNA来验证，该酶可降解线性RNA，但不会降解circRNA。RPA分析也可用于绘制蛋白质-RNA相互作用的图谱：当蛋白质在目标序列上与RNA结合时，它将阻止RNase H的裂解，并指示蛋白质与RNA之间的相互作用位点（图3 A）。
RNA下拉测定
该测定法使用已知circRNA的探针来研究推定的蛋白质结合伴侣。这些DNA寡核苷酸探针与链霉亲和素包被的磁珠缀合。然后，将细胞培养物在冰冷的磷酸盐缓冲液中洗涤，并在co-IP缓冲液中溶解，然后在室温下与生物素化的DNA寡核苷酸探针一起孵育。然后将链霉亲和素结合的磁珠添加到每个结合反应中。在该系统中，探针与circRNA结合，链霉亲和素包被的磁珠的结合使目标circRNA和任何结合的蛋白质伴侣一起被拉下。然后洗涤珠子，并通过蛋白质印迹或质谱法确认结合的蛋白质。在此过程中，有几个重要步骤：（1）circRNA必须用RNAse R纯化；（2）探针应特异性靶向circRNA的反向剪接连接区域；（3）由于其复杂的三级结构，circRNA可能会拉低非特异性结合蛋白，图3乙）。
RNA免疫沉淀（RIP）
RNA结合，随后circRNA测序蛋白免疫沉淀分析（RIP）是用于分析circRNA -蛋白质相互作用另一种可行的策略。与RNA下拉测定法相反，RIP通过靶向蛋白质来检测RNA。简而言之，在功能测定中，将细胞在冰冷的PBS中洗涤，在co-IP缓冲液中裂解，并与靶向目标蛋白质的一抗一起孵育。将总计50％的蛋白A Sepharose浆液添加到每个样品中，并将混合物孵育。沉淀用PBS洗涤并重悬于TRI试剂中。然后对水溶液中洗脱的共沉淀RNA进行qRT-PCR分析，以证明circRNA结合伴侣的存在（图3 C）。
电泳迁移率变动分析（EMSA）
EMSA是一种常用的亲和电泳技术，用于研究蛋白质-DNA和蛋白质-RNA的相互作用。该程序可以确定一种蛋白质或蛋白质混合物是否能够与给定的RNA序列结合，并且有时可以表明结合复合物中是否涉及一个以上的蛋白质分子。孵育circRNA和蛋白质，并在自然条件下通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶对所得混合物进行电泳。电泳后，用抗目的蛋白质的特异性抗体通过蛋白质印迹法确定含有circRNA的物质的分布。通常，circRNA-蛋白复合物迁移的速度比相应的游离circRNA慢（图3 D）。
荧光原位杂交（FISH / ISH）
FISH / ISH可通过使用DNA寡核苷酸探针和特异性的荧光标记抗体来检测circRNA-蛋白结合，从而确定结合位置。简而言之，将细胞或冷冻组织切片固定，然后透化以允许靶标可及性。由20个碱基对组成的荧光标记的目标特异性探针与目标RNA杂交。信号放大是通过一系列顺序杂交步骤实现的。在测定的最后，在荧光显微镜下观察组织样品。
结论与展望
在这篇综述中，作者总结了circRNA的生物发生，特征，蛋白质相互作用和翻译，以提供有关circRNA-蛋白质相互作用的功能机制的当前知识的概述。
在有限的空间条件下，环状分子可能能够结合更多的蛋白质，从而使它们能够充当蛋白质海绵，诱饵，稳定剂，支架，蛋白质募集者以及蛋白质本身。此外，环状支架（例如circRNA）对于蛋白质以特定的空间方向组装可能至关重要。证据表明，circRNA不仅可以通过结合基序与蛋白质结合，还可以通过基于其三级结构的相互作用与蛋白质结合。有趣的是，circRNA-蛋白质相互作用以动态方式影响了两个伴侣。尽管已经鉴定出在不同组织和疾病中成千上万个假定的circRNA，并且已经进行了circRNA的许多功能蛋白质组学研究，但旨在直接揭示circRNA-蛋白质相互作用机理的研究仍然有限，这可能是由于当前的技术局限性所致。缺乏相关且有效的体内研究方法可能是该领域的重要障碍。
本文还回顾了用于研究circRNA与蛋白质之间相互作用的方法，并且所采用的方法可以分为基于circRNA或基于蛋白质的方法。然而，已经进行了有限的研究来确定circRNA和蛋白质伴侣的三级结构如何促进它们在体内的相互作用。
circRNA研究中最吸引人的领域与外泌体有关。已显示外来体可减少circRNA的积累并协助circRNA清除，从而提供circRNA降解的证据。此外，外泌体不仅因为它们容易进入体液而成为细胞之间的信使，而且因为它们还可以携带circRNA，从而促进了生物学信息和物质向靶细胞的转移。此外，外泌体可以保护circRNA免受细胞清除。然而，外泌体形成过程中circRNA富集的机制尚不清楚。
另一个有趣的领域是免疫学。直到2017年，Chang等 据报道，细胞既可以识别细胞中产生的内源性circRNA，也可以识别与视黄酸诱导基因1蛋白（RIG-1）体外合成的外源性circRNA （图1 K）。然而，只有在识别出外源性circRNA后，RIG-1才激活对病毒感染的自身免疫途径。相比之下，在2019年3月，安德森（Anderson）等人报道了转染到细胞中的外源性合成circRNA不能刺激免疫途径。他们提出，先前报道的对circRNA的免疫反应是由于样品纯度不足所致，这可能是由于存在带有5'磷酸基团的线性RNA的非特异性作用所致。但是，后来后来被Chang和同事反驳了，他们证实了他们以前的结果。他们表明，人circRNA 的m6A RNA修饰消除了免疫基因的激活和固有免疫的佐剂活性。未修饰的circRNA，不是m6A-修饰的circRNA直接激活RNA模式识别受体RIG-1。除外源性circRNA外，内源性circRNA还可引起免疫反应。内源性circRNA可以用作抗病毒蛋白（如NF90 / NF110）的“分子指标”，其通过诱使细胞核中的病毒蛋白诱变并输出到细胞质中来抑制病毒复制，从而引发抗病毒免疫反应。
虽然有circRNA研究现有的许多冲突和争议，作者希望看到circRNAs越来越多的研究，因为这些RNA都提出了包括新一代的预测性生物标志物和治疗靶点。
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