科研 | 越桔改善高脂肪饮食诱导的大鼠结肠粘液动态变化并恢复紊乱的肠道微生物群
编译：Keven.C，编辑：十九、江舜尧。
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高脂饮食(HFD)与肠道微生物群失调及其相关疾病有关，而越桔对肠道健康具有益处。文章讲述了在高脂饮食和越桔膳食干预下，结肠黏液层的动态变化和肠道微生物组的变化。本文研究了在低脂或高脂饲料喂养下，对大鼠进行8周的越桔膳食干预是否影响大鼠结肠黏液层厚度和微生物组成(使用方法为Illumina测序和实时荧光定量PCR)。结果显示，HFD引起明显的局部结肠反应，但没有观察到大鼠的体重增加或全身炎症，HFD引起了结肠上皮一氧化氮合酶(iNOS) 的上调，而越桔可以抑制HFD诱导的一氧化氮合酶的上调。在HFD的诱导下，结肠黏液层变厚，Muc2和Tff3的mRNA水平升高，但越桔的干预不抑制此现象。同时，HFD降低结肠黏液溶解性细菌Akkermansia muciniphila和Bacteroide spp.的丰度。最后，越桔可以缓解HFD诱导的微生物群失调和致病菌的扩张，例如Enterobacteriaceae等。结论：在诱导至肥胖前，高脂饲料能明显增加黏液厚度，减少细菌定在居肠道粘液。越桔能预防HFD导致的肠道炎症和微生物群入侵。
论文ID
原名：High Fat Diet Enriched with Bilberry Modifies Colonic Mucus Dynamics and Restores Marked Alterations of Gut Microbiome in Rats
译名：富含越桔的高脂肪饮食可以改善大鼠结肠粘液动态恢复肠道微生物群的显著变化
期刊：Molecular Nutrition & Food Research
IF：4.65
发表时间：2019年7月
通信作者：Hao-yu Liu
通信作者单位：瑞典乌普萨拉大学医学细胞生物学系
实验设计
32只4周龄的SD大鼠分为4组：低脂饮食组（LFD），低脂饮食加越桔膳食干预组(LFD+BB)，高脂饮食组(HFD)，高脂饮食加越桔膳食干预组(HFD+BB)(Table1)。干预期为8周，自由饮水饮食。每周记录进食量和大鼠体重。检测了结肠粘液厚度；远端结肠的mRNA转录变化和免疫组化以及髓过氧化物酶（MPO）；肝脏重量，葡萄糖耐受测试。使用ANOVA以及tukey's post-hoc进行组间比较分析。皮尔森相关系数用来解释相关性。使用VEGAN 和R对16s RNA的数据进行分析。
结果
在这8周的饮食干预中，在HFD组和LFD组以及LFD+BB组中，大鼠体重和能量摄入没有变化(Figure 1A-B)。但是HFD+BB组在高能量摄入下其体重低于高脂饮食组(Figure 1C, p < 0.01)。HFD组大鼠的肝脏重量(15.4 ± 0.67 g)比LFD组(13.0 ± 0.60 g, p <0.05)，LFD+BB组(12.3 ± 0.36 g, p < 0.01)和HFD+BB组(11.3 ± 0.3 g, p < 0.0001)更重。HFD组粪便脂肪含量较LFD组高(Figure 1D, p < 0.0001)，在HFD+BB组中越桔的摄入降低了粪便脂肪含量(p < 0.0001)。各组间的血糖和葡萄糖耐受没有变化(Figure 1E-F)。
作者检测了血清中，IL-1β，IL-4，IL-13和TNFα的含量，但是含量低于检测限无法检出。我们检测了CXCL-1, IFN-γ, IL-5 和IL-6，但各组间没有区别(Figure 2A)，表明高脂饮食没有诱导系统性炎症。HFD组大鼠结肠中iNOS mRNA升高，但是越桔对其产生了显著的抑制(Figure 2B, p < 0.01)。免疫组化也显示了同样的结果(Figure 2C-E, p < 0.001)。为检测白细胞浸润，检测了结肠中MPO含量，HFD组和LFD组MPO含量没有区别，但是HFD+BB组降低了MPO水平(Figure 2F, p = 0.05)。
Figure 3A-C描述了粘液层厚度的测量方法。LFD组的牢固粘附黏液层厚度与HFD组相比明显增加(p < 0.001)，HFD+BB组较HFD组牢固粘附黏液层厚度微量减少，但具有显著性(Figure 3D, p < 0.05)。松散粘附黏液层厚度在各组间没有变化(Figure3E)。HFD组中的Muc2 和Tff3 mRNA上调了（Figure 3F-G, p < 0.05)。这些数据说明了HFD组在有无越桔干预的情况下都影响粘液的分泌和牢固粘附黏液层厚度。在HFD和HFD+BB组间，牢固粘附黏液层厚度的显著的变化是归因于越桔诱导了iNOS的表达，因为粘液的分泌是由iNOS调控(Figure2B-E)。PAS染色量化了远端结肠内的杯状细胞(Figure 4)。HFD组的杯状细胞总量和成熟杯状细胞的比例与LFD组相比较低(Figure 4A-C, p < 0.001)。越桔的干预恢复了HFD诱导的杯状细胞总数的降低(p <0.001)。越桔干预都会使得LFD和HFD组的隐窝的长度变短(Figure 4D, p < 0.05)。
第一，高脂饮食显著影响肠道菌群的组成，进而造成代谢紊乱。我们用16s RNA和PCR检测肠道菌群的组成。首先，HFD组与LFD相比，HFD降低了80%肠道菌群的含量(Figure 5A, p < 0.05)，HFD-BB组缓解了其降低。(LFD+BB组的肠道菌群含量是LFD组的两倍。各处理组中，粘液层中的菌群含量没有变化)与粪便相比较，菌群的含量在松散粘液层很少，在牢固粘液层更少。
第二，多维尺度分析揭示了在不同膳食影响下不同的肠道菌群组成(Figure 5B). HFD是导致肠道菌群组成紊乱的首要因素。与LDF相比较，越桔干预组(LFD+BB and HFD+BB)改变了肠道菌群的组成。HFD减少了肠道菌群的α多样性(Figure 5C)，(p < 0.01)。在粪便样品中HFD显著提高了Firmicutes/Bacteroidetes的比例(Figure 5D, p <0.001)，HFD+BB组恢复了这一改变，与LFD和LFD+BB相同(p <0.001)。HFD减少了以Bacteroidaceae科为代表的Bacteroidetes门和以Verrucomicrobiaceae为代表的Verrucomicrobia门的含量(Figure 5E, Figure S1, FDR adj. p < 0.05)。相比之下, HFD提高了以Peptostreptococcae, Clostridiaceae为代表的Firmicute门和以Enterobacteriaceae科为代表的Proteobacteria门的含量。HFD+BB缓解了大部分HFD造成的菌群改变，除了Verrucomicrobiaceae的含量与HFD相同(Figure 5E, FDR adj. p < 0.05)。另外HFD+BB提高了以Bifidobacteria为代表的Actinobacteria门的含量(Figure S1, Table S3, FDR adj. p <0.05)。最后，我们确定了249个OTUs对肠道菌群的组成的变化有贡献。当肠道菌群丰度基线设置到0.05%时，27个OTUs在HFD组和HFD+BB中是增加的，28 OTUs 是减少的(Figure 6A-B, Table S3). 9 unique OTUs (属于Peptostreptococcae, Clostridiaceae 和Enterobacteriaceae 科) 在HFD组显著提高，占据了77%菌群群落的变化，而在LDF组这些菌几乎都检测不出来。在健康状态下，肠道菌群包含着很多低丰度的致病菌，这些致病菌可能在病理状态下增加。我们针对Enterobacteriaceae和Lactobacillaceae，使用PCR来进一步确定了由HDF诱导造成的病原菌的爆发和共生菌的减少。HFD增加了Enterobacteriaceae的数量，HFD+BB减少Enterobacteriaceae的数量到LFD组的水平(Figure 6C, p < 0.001)。与LFD+BB组相比，HFD和HFD+BB减少了Lactobacillaceae含量 (Figure 6D, p < 0.05)。
粘液溶解细菌Akkermansia muciniphila对维持粘液更新很重要。Akkermansia muciniphila(OTU6，99% 16S rRNA)和Verrucomicrobiaceae的减少在HFD和LFD组间造成了很大的差异。在 HFD (Figure 7A,FDR adj. p < 0.05)。另外一组丰度为20%的细菌是属于Bacteroides Spp，其在LFD组和LFD+BB组占据了20%的细菌总量(Figure 7B)。Bacteroides sp.的相对丰度在HFD and HFD+BB显著降低(Figure 7B, FDR adj. p < 0.05)。皮尔森相关分析揭示了牢固粘液层厚度跟Akkermansia muciniphila(Figure 7C, p < 0.05)以及Bacteroides sp.(Figure 7D, p < 0.001)的丰度有很强的负相关性。Q-PCR的结果也确定了Akkermansia muciniphila和Bacteroides spp在HFD干预下显著降低了，HFD+BB组增加了所有的粘液细菌。与LFD相比，LFD+BB增加了Akkermansia muciniphila含量(Figure 7E-G, p < 0.05)。这些数据显示无论在LFD还是HFD的干预下，越桔的膳食干预都增加粘液细菌的数量(Figure 7A-B)。
讨论
此研究中，我们证明了高脂饮食增加了结肠牢固粘液层的厚度，同时减少粘液溶解性细菌的数量。HFD喂养幼鼠既不引起肥胖，也不引起全身炎症，但是造成了低度结肠炎症，表现为一氧化氮合酶和微生物致病菌含量升高和肠道菌群紊乱(减少细菌总数和α-多样性，Firmicutes/Bacteroidetes的比例变化、Enterobacteriaceae和Clostridiaceae增加)。越桔的摄入能够完全消除高脂诱导下的局部炎症，对细菌的数量有明显的恢复作用。有研究证明在饮食中添加成胶纤维可促进粪便成块和排泄，这可能解释了HFD+BB组的大鼠能量转化率高，体重变轻。
此外，作者发现，高脂饮食减少粘液溶解性细菌A. muciniphila，B. rodentium和B. fragilis，这一点解释了在HDF组中更厚的结肠牢固黏液层和肠道屏障。肠道中有数以亿计的肠道共生菌。黏液层紧贴肠道上皮成为肠道屏障的一部分。通过体外技术和人结肠切片，牢固黏液层可以被观察到。本研究中，我们发现了细菌在肠腔-松散粘液层-牢固黏液层的梯度分布，也证明了牢固粘液层阻挡致病菌的侵入。之前的实验表明，高脂饮食破坏肠道屏障包括肠道上皮萎缩，内黏液层变薄，细菌的侵入等。但在本研究中，牢固黏液层细菌数量的在高脂饮食时没有变化，表明并没有发现黏液层细菌入侵。我们还发现在HFD和HFD+BB组中牢固黏液层变厚。Muc2和Tff3的上调也支撑这一结果。在上皮和隐窝中，HFD组中iNOS上调表明有局部炎症发生，而此炎症完全被越桔缓解。作者之前的研究表明NO从iNOS的释放能够刺激结肠粘液的分泌，但是在HFD诱导下，尽管iNOS升高，本文也没有看到这个现象。在HDF诱导下，杯状细胞的总数和成熟细胞的比例下降，这可能是由于杯状细胞的枯竭，因为很多研究表明结肠缺血和炎症导致了杯状细胞枯竭，同时有大量粘液的分泌。而越桔的加入能够提升杯状细胞的数量。粘液厚度是由粘液合成和肠道细菌分解决定。粘液溶解性细菌分为两个类别：一是在粘液上附着生长，二是有多糖分解酶可生活在粘液基质中。在健康人体中，A. muciniphila组成了15%的肠道菌群，只能生长在结肠粘液蛋白上的多糖结构上，对人体肠道健康很重要。在HDF的诱导下，A. muciniphila，B. rodentium和B.fragilis下降了，这与之前的很多研究结果都一致。但越桔的加入可以缓解这一症状。我们发现粘液溶解性细菌与牢固黏液层厚度有负相关性。HFD组没有系统性炎症的原因可能因为更厚的牢固黏液层。但是与HFD-BB相比，HFD组有更少的分泌粘液的杯状细胞，可能会最后导致肠道屏障的损坏。由于粘液特殊的结构，一些粘液溶解性细菌很喜欢在其中生长。与松散粘液层相比，牢固粘液层的B.Rodentium和B. fragilis含量更多。结果显示牢固黏液层的厚度大概是0-40微米，而无菌粘液层为0-25微米。无菌粘液层可能是牢固黏液层的一部分。我们因此猜测，A. muciniphila, B. rodentium 以及B. fragilis可以调节牢固黏液层的厚度（通过多糖分解酶），将牢固黏液层变为松散粘液层。
最近的研究表明，移植肥胖鼠的肠道菌群到无菌鼠中可以诱导肥胖，表明肠道菌群更多的是宿主炎症的原因而不是结果。作者的实验结果表明，越桔可以调节HFD诱导的肠道菌群紊乱。因此作者推测，在诱导至系统性炎症和肥胖前，高脂干预下的这些病理改变可以被某些膳食益生元改变或者缓解。
结论
作者证明了在高脂饮食下，越桔的膳食干预可以缓解肠道菌群紊乱和局部肠道炎症。在HFD干预下，在大鼠获得系统炎症之前，牢固粘液层厚度增加。提供了粘液动态变化与粘液溶解性细菌A. muciniphila和Bacteroides spp.的直接关系。
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