科研 | Nature Medicine：肥胖者经过减肥干预后肠道微生物组及血清代谢组的变化（国人作品）

本文由一只科研汪编译，董小橙、江舜尧编辑。

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导  读

越来越多的证据表明人类的肥胖与肠道微生物有关。我们对一组来自中国健康的瘦人和肥胖者进行了宏基因组关联研究和血清代谢组学分析，发现与肥胖与肠道微生物的种类及循环代谢物的变化有关。肥胖者体内多形拟杆菌的丰度显著降低，且与血清中谷氨酸盐浓度呈负相关。与此一致的是，给小鼠灌胃服用多形拟杆菌后，小鼠血清中谷氨酸盐浓度下降，并缓解了由于饮食导致的小鼠体重增加及肥胖。此外，通过减肥手进行的减重干预也可部分逆转肥胖者体内与肥胖相关的微生物及代谢的变化，包括多形拟杆菌丰度的降低及血清谷氨酸盐水平的升高。本文首次发现了肠道微生物与循环氨基酸及肥胖之间的关系，提示靶向肠道微生物的方法有望成为一种肥胖干预的措施。

论文ID

原名：Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention.

译名：肥胖者经过减肥干预后肠道微生物组及血清代谢组的变化

期刊：nature medicine

IF：32.621

发表时间：2017.06.19

通信作者：Weiqing Wang¹, Karsten Kristiansen^3,4,5, Guang Ning^{1, 2}

通信作者单位：¹上海交通大学附属瑞金医院，²中国科学院上海生命科学研究院，³上海交通大学医学院，⁴深圳华大基因研究院，⁵哥本哈根大学基因组学和分子生物医学实验室

实验设计

试验设计流程图

实验内容

1. 通过宏基因组关联研究发现了与肥胖相关的基因及分类学出现的变化

我们对257份粪便样本（第一组队列中包含72例肥胖者和79例瘦人共151例，第二组23例肥胖者和26例瘦人共49例，以及来自23例肥胖者的63份样本，其中包括6例接受过袖状胃减容术的病人）进行鸟枪法测序。我们首先比较了72例肥胖者（BMI 36.78 ± 4.46 kg/m²; 年龄23.6±3.7岁）和79例对照组（BMI 20.2±1.3 kg/m²; 年龄23.2±1.8岁）肠道内微生物的不同。与之前欧洲人群的研究结果相一致，我们发现这些肥胖人群的基因数和菌群的多样性都明显低于对照组(Fig. 1a-c)，说明说明肥胖人群肠道菌群的基因丰富度较低。此外，在肥胖者的肠道微生物组中我们观察到更高的β多样性，这表明肥胖个体之间肠道的菌群结构组成比瘦对照组更为复杂(Fig. 1d)。

然后，我们将350,524个肥胖相关的标记基因使用宏基因关联组（MLGs）进行分组，并且发现217个与肥胖相关的至少包含了100个基因的MLGs（Supplementary Table 3）。这些MLGs被用来构建MLG网络来描述与肥胖相关的肠道微生物标志物。尤其是，对照组富集的MLGs比肥胖组富集的MLGs具有更高的关联性(Fig. 1e)。我们基于更新后的参考宏基因组，对肥胖相关肠道微生物进行分类，进一步得到了被注释到20种细菌的73个MLGs(Supplementary Tables 4 和5和Supplementary Fig.3a–c)。其中，MLGs被注释到Akkermansia muciniphila和Fecalibacterium prausnitzii这两种肠道细菌（曾经被报道过可分别对抗肥胖和抑制炎症）在瘦人对照组有明显的富集。此外，我们还发现了一个由多形拟杆菌、单形拟杆菌、解木聚糖拟杆菌、卵形拟杆菌和类杆菌相对应的MLGs在瘦人对照组中也出现明显的富集(Fig.1e)。此外，Ruminococcus torques，Ruminococcus gnavus, Dorea longicatena, Dorea formicigenerans, Coprococcus come, Lachnospiraceae bacterium, Fusobacterium ulcerans 和Fusobacterium varium的MLGs在肥胖者中有高度的富集(Fig.1e)。这些数据共同揭示了肥胖者肠道微生物的变化，表明肥胖者肠道内微生物处于一种失衡状态。

Fig1. 年轻肥胖者肠道微生物的改变

2. 肠道微生物的种类与临床指标的关系

为了确定肥胖患者的临床指标与肠道微生物变化的相关性，我们进行了方差排列分析(PERMANOVA)，发现与肠道菌群改变相关的有BMI和27个代谢指标（包括糖化血红蛋白、胰岛素抵抗稳态模型评估、血脂浓度、炎症因子、脂肪因子）。采用随机森林回归分析各临床指标的MLGs相对丰度。值得注意的是，在151份样本中，26个MLGs与BMI最匹配，并在其他49名受试者的测试组中保持稳定(Fig. 2a)。B.thetaiotaomicron, B.intestinalis和B.ovatus的MLGs在对照组富集中与BMI最匹配(Fig. 2a)。在49名受试者实验中，对照组中的这些肠道微生物与肥胖组相比也有高度富集(Supplementary Fig. 4)。此外，通过随机森林回归和斯皮尔曼相关分析发现这些MLGs与体脂、胰岛素抵抗和炎症这些代谢指标也具有相关性(Fig. 2a)。

瘦素和脂联素是两种脂肪细胞来源的激素，循环瘦素浓度随肠道菌群定植而增加。我们发现F.prausnitzii和B.thetaiotaomicron与循环中瘦素浓度呈负相关，与循环脂联素浓度呈正相关。D. longicatena与循环瘦素浓度呈正相关，与循环脂联素浓度呈负相关(Fig.2b)，表明这些微生物可能是连接肠道菌群和循环代谢的潜在生物标志物。

Fig2. 肠道微生物的种类与临床指标的关系

3. 肥胖组肠道菌群的功能特征

我们从至少6个样本中找到了5,705 KEGG同源序列（KOs），其中584KOs在瘦人与肥胖者之间存在显著差异(Supplementary Table 10)。此外，与瘦对照组相比，肥胖个体肠道细菌的“磷脂转移酶系统”代谢通路高度富集，且磷脂转移酶系统模块与厚壁菌门物种呈正相关。相反，与瘦对照组相比，肥胖组肠道菌群中涉及“柠檬酸循环”通路的基因被消耗。然而，与瘦对照组相比，肥胖组肠道菌群中涉及碳水化合物代谢的途径（包括“果糖和甘露糖代谢”、“半乳糖代谢”和“淀粉和蔗糖代谢”）都有高度的富集。

先前的研究表明A. muciniphila和B. thetaiotaomicron具有维持肠上皮屏障的作用。因此，消耗这些微生物可能会损害肠道屏障的完整性，导致更多的脂多糖(LPS)被转运到循环中并诱导炎性因子（TNFα和IL6）。我们发现LPS生物合成以及肽聚糖生物合成相关基因的丰度在肥胖者肠道菌群中要高于对照组肠道菌群，这可能与肥胖者血清种高浓度的LBP，TNFα和IL6相关。此外，与瘦对照相比，肥胖个体中涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的氨基酸代谢相关通路和谷氨酰胺/谷氨酸转运系统高度富集，而与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路相关的微生物基因被耗尽。因此，肥胖者肠道菌群产生芳香氨基酸(AAA)和支链氨基酸(BCAA)的潜能可能会高于瘦对照组。

4. 肠道微生物与宿主循环代谢之间的关系

近来研究报道了有一种血清代谢物的变化可以反映2型糖尿病患者和健康人肠道菌群的差异。为了研究汉族肥胖者肠道菌群的改变是否与与宿主体内循环代谢物有关，我们对肥胖组和对照组人群的血清进行了非靶向代谢组学分析。与对照组相比，肥胖个体表现出明显的代谢变化。在肥胖组与对照组之间，我们共鉴定出了148种差异代谢产物。氨基酸的靶向代谢组学进一步证实了瘦人和肥胖者之间代谢物的差异。总的来说，肥胖个体和瘦对照组之间，血清中34种氨基酸中有显著性差异的共有20种。为了进一步研究循环代谢物丰度的变化是否与肠道菌群的改变有关，我们采用CIA（co-inertia analysis）分析发现217 MLGs和148个代谢物（肥胖组和对照组之间的差异代谢物）之间的共变，说明这些氨基酸与肥胖者肠道菌群的改变密切相关。具体来说，这些氨基酸与拟杆菌（包括B.thetaiotaomicron，B.intestinalis，B.ovatus和B.uniformis）呈反比关系(Fig. 3a)。据报道，B.thetaiotaomicron和B.ovatus可以发酵AAA产生苯乙酸。综上所述，我们的结果表明肠道微生物群的改变，特别是肥胖者肠道内拟杆菌属的减少可能与循环中较高的AAA和BCAA浓度有关。这些氨基酸又是2型糖尿病和心血管疾病(CVD)的危险因素，并且我们实验观察到这些氨基酸还与HOMA-IR、高血糖、高脂血症和循环炎性因子呈正相关。

在检测到的氨基酸中，与瘦对照组相比，肥胖者体内谷氨酸盐的增加最为显著。谷氨酸与16个肥胖组富集的MLGs呈正相关，与18个对照组富集的MLGs呈负相关(Fig.3a)。尤其是，肥胖组富集的Ruminococcus sp., D. longicatena，C. comes和OB-8293还含有编码催化谷氨酰胺生成谷氨酸的基因(Fig.3b)，并且这些微生物与循环中谷氨酸水平呈正相关，与谷氨酰胺水平呈负相关。这些观察结果表明，循环中谷氨酸和谷氨酰胺的水平可能反映了这些细菌种类丰度的变化。

此外，血清谷氨酸水平与B.thetaiotaomicron的丰度呈负相关(Fig.3a)，B.thetaiotaomicron含有编码谷氨酸脱羧酶的基因(K01580,Fig.3b)。这些结果表明，体内B.thetaiotaomicron的消耗可能导致肥胖人群中谷氨酸循环浓度升高。此外，血清谷氨酸的浓度与肥胖组表现出正相关性的特征如BMI、WHR、腰围、HOMA-IR、hsCRP和三酰甘油。以上数据表明，肠道菌群的代谢可能与血清中肥胖相关氨基酸的水平有关。

Fig3. 肠道微生物与血清氨基酸的关系

5. B.taiotaomicron对肥胖及宿主代谢的影响

B.taiotaomicron是人类肠道的优势菌群，其减少与肥胖和血清氨基酸浓度有关。在此基础上，我们接下来研究了肠道内的B. thetaiotaomicron与宿主肥胖之间可能存在的关系。对正常饮食的老鼠进行B. thetaiotaomicron活菌灌胃，可以显著降低小鼠总脂肪量和腹股沟脂肪量(Fig. 4a–c)。此外，它还能减轻高脂饮食(HFD)导致的小鼠肥胖(Fig.4d–f)。给HFD小鼠灌胃B. thetaiotaomicron活菌，与给小鼠灌胃磷酸盐缓冲液(PBS)或加热灭活过的B. thetaiotaomicron菌相比，灌胃活菌的HFD小鼠血脂联素浓度较高，而瘦素浓度较低(Fig. 4g,h)。

对白色脂肪组织进行病理学分析显示，HFD小鼠灌胃PBS或热灭活过的B.thetaiotaomicron与灌胃B. thetaiotaomicron活菌相比，灌胃活菌组的小鼠脂肪细胞体积要小得多(Fig.4i,j)。此外，B. thetaiotaomicron活菌灌胃HFD小鼠后，小鼠白色脂肪组织中参与编码合成脂肪的蛋白质基因的mRNA（包括Srebf1，Scd1和Fasn）有降低，而脂类分解和脂肪酸氧化相关基因（包括Adrb3，Pnpla2，Cpt2，Acox1和Ppargc1a）的表达有升高(Fig.4 k)。此外，HFD小鼠脂肪组织中炎症标志物Cd68, Ccl2, Il6和Il1b的表达在灌胃活菌B. thetaiotaomicron后下降，表明炎症状态改善(Fig.4l)。尤其是，我们发现活菌B. thetaiotaomicron灌胃HFD小鼠后，小鼠体内谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸等循环氨基酸的丰度明显低于PBS组小鼠（Fig.4m）。值得注意的是，已经有多篇文献证实在谷氨酸诱导的肥胖中，脂肪分解会减少及脂肪细胞变大。

Fig4. 补充B.thetaiotaomicron 对肥胖及宿主代谢的影响

6. 袖状胃减容术对肠道微生物群和代谢的影响

为了进一步研究肠道菌群、循环氨基酸和临床表型之间的关系，我们接下来分析了23例进行袖状胃减容术（SG）后的肥胖个体在0M、1个月(1M)和3个月(3M)时这些参数的变化。我们采用随机森林分类方法来区分肥胖者和瘦人，该分类方法是基于病例对照研究中MLGs相对丰度的。采用此分类方法，我们对收集的151例样本进行ROC曲线分析发现，AUC值为0.9687,而49例样本分析后AUC值为0.9214。使用同样的分类方法我们发现肥胖者经SG手术后的肠道菌群接近于瘦对照组肠道菌群(Fig.5a)。这些数据表明，肥胖个体经过SG术后及减重后体内肠道菌群与瘦对照组更加相似。

在功能上，34个肥胖相关KEGG通路中有17个在术后三月时变得不那么明显。此外，在瘦对照组和SG术后三个月组中，与肥胖相关的24种KEGG通路的丰度没有显著差异。这些结果表明，SG后，大量微生物酶功能变得更类似于瘦对照组。这些微生物功能包括碳水化合物发酵、柠檬酸循环、粘多糖降解和脂多糖合成的途径，以及AAA和BCAA的产生。我们进一步发现，在1M时，14例实验组富集的MLGs的丰度降低。3M时，20例实验组富集的MLGs的丰度显著降低。而在对照组1M和3M时，分别有8例富集的MLGs和37例富集的MLGs的丰度显著增加。其中包括肥胖组富集的C.comes和D.longicatena的MLGs，以及对照组富集的梭菌属、Anaerotruncus colihominis、A. mucinila和B. thetaiotaomicron的MLGs。值得注意的是，MLGs注释为B. thetaiotaomicron在3M时显著增加甚至接近瘦对照组的水平(Fig. 5b)。此外，由GEE分析显示，SG后B. taiotaomicron的丰度增加与BMI的降低有关(Fig.5c)。此外，我们检测到SG术后循环谷氨酸水平显著下降(Fig.5d)。值得注意的是，大鼠体内B. thetaiotaomicron含量的增加与循环谷氨酸水平的降低有关(Fig. 5e)。此外，编码谷氨酸代谢酶的基因丰度在0M和3M组间也存在差异。最后，循环谷氨酸浓度降低还与SG后高血糖、胰岛素抵抗、血清中瘦素的浓度和hsCRP等炎症标志物的升高有关。这些结果进一步证明细菌种类(如B. thetaiotaomicron)丰度的改变可能会影响与肥胖并发症相关的循环氨基酸代谢。通过SG进行的减肥干预在一定程度上可以修复肠道菌群和代谢的紊乱。

Fig5. 袖状胃切除术减肥干预过程中微生物和代谢的变化

评  论

在我国，心血管疾病及2型糖尿病的发病率正逐年增加，而肥胖正是导致这两种慢性代谢性疾病的主要病因。该研究利用宏基因组学结合代谢组学的方法首次揭示了汉族人群中肠道菌群、血清氨基酸与肥胖之间的关系，预示着，通过靶向肠道菌群的方法来治疗肥胖是可行的。