科研 | 乳酸杆菌促进肠道干细胞再生！（国人作品，IF：8.399）
导读
肠道隐窝基部的肠道干细胞（ISCs）具有调控肠上皮细胞的增殖和分化的重要作用。虽然对调控ISCs功能的宿主内途径的理解已有进展，但外源因素对ISCs生物学的影响仍然知之甚少。
益生乳酸杆菌是肠道微生物群的重要组成部分。乳酸菌可以增强肠道屏障的完整性并减少疾病表型，如胃肠道感染和IBD。然而，乳酸杆菌对ISCs的影响仍不清楚，可能是因为缺少合适的体外模型。
本研究的目的是探讨Lactobacillus reuteri D8对LPLs的刺激作用及其对IL-22分泌和ISCs再生的影响，旨在阐明乳酸杆菌通过促进ISCs发挥对肠上皮的保护作用。
原名：Lactobacillus accelerates ISCs regeneration to protect the integrity of intestinal mucosa through activation of STAT3 signaling pathway induced by LPLs secretion of IL-22
译名：乳酸杆菌通过激活LPLs分泌IL-22诱导STAT3信号途径，加速ISC再生以保护肠粘膜的完整性
期刊：cell death and differentiation
IF：8.399
发表时间：2018年
通信作者：Qinghua Yu
通信作者单位：南京农业大学
1、建立肠道类器官和LPL共培养模型
本研究建立了肠类器官和LPL的共培养系统（图1a）。LPL和肠类器官以7：1的比例培养于Matrigel（人工基底膜）中，可以从细胞培养孔中直接观察肠类器官和LPLs（图1b）。培养第3天，类器官开始出芽（图1c）。
图 1
2、在TNF-α损伤后，D8促进肠类器官的生长和恢复
采用肠道类器官和LPLs的共培养模型检测L.reuteri D8或热灭活D8（HK-D8）是否促进TNF-α损伤后的肠类器官生长和恢复。结果发现：与对照组和HK-D8组相比，L. reuteriD8显著增加出芽类器官的表面积和数量（图2a）。鼠源TNF-α（60 ng/mL）导致受损的类器官的数量显着增加（图2b）。然而，L. reuteri D8显着改善了TNF-α引起的肠类器官损伤（图2c）。但是，HK-D8对肠类器官没有保护作用（图2c）。TNF-α引起肠类器官形态学损伤，隐窝只有少量EdU阳性细胞（图2d）。然而，D8显着增加了EdU阳性细胞的数量，进而增加了出芽类器官的表面积和数量。此外，D8在TNF-α损伤的隐窝中也可以维持EdU阳性细胞数量，从而加速了恢复过程。但是，HK-D8对上皮细胞增殖没有刺激作用。
图 2
3、D8促进肠道生长并改善DSS诱导的小鼠结肠炎
BacLightTMGreen标记的L. reuteri D8灌胃后，在小鼠空肠和结肠定植，为D8与肠上皮的接触提供了机会（图3a）。此外，D8灌胃16小时，乳杆菌浓度达到106CFU/g粪便，表明L. reuteri D8可以定植于肠腔并与肠粘膜接触（图3a）。
对照组和D8处理组小鼠持续增重，而DSS处理组小鼠在DSS处理3天后，体重开始下降。但是，D8显著地缓解了DSS引起的体重减轻（图3b）。与对照组相比，DSS处理显着降低结肠长度，而D8缓解了DSS诱导的结肠长度减少（图3c）。组织病理学切片发现，DSS组小鼠出现明显的肠道水肿和结肠组织黏膜层的致密浸润，以及结肠腔和肌层的病理性出血（图3d）。而D8改善了DSS引起的病理改变，D8+DSS组的结肠结构正常并且没有出血。
D8处理组小鼠的绒毛比对照组小鼠更长、更深。此外，与DSS组相比，D8改善了肠道结构损伤，显著增加了绒毛高度和隐窝深度（图3f）。
DSS处理损伤了空肠和结肠形态，并且增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞的比例显著降低。然而，D8不仅在生理状态下显著促进PCNA阳性肠上皮细胞增殖，并且改善了DSS导致的受损的增殖状态，加速复原过程（图3e，g）。此外，与DSS处理组相比，D8+DSS组小鼠的TNF-α和IL-1β的蛋白质水平显着降低（图3h）。
图 3
4、D8增加Paneth细胞的数量并在损伤后刺激ISCs再生
ISCs对损伤引起的肠道再生至关重要。Lgr5是一种ISCs标记物，主要在肠隐窝基部标记ISCs。结果发现：与TNF-α组相比，D8显著增加Lgr5阳性细胞的数量（图4a）。此外，Lgr5的蛋白质表达（图4b）和ISC标记物（Lgr5，Olfm4和Ascl2）的mRNA表达（图4c）进一步验证了D8对ISCs的刺激作用。并且，D8增加了Lgr5阳性细胞的数量并改善了DSS引起的空肠Lgr5阳性细胞数量的减少（图4d）。
本研究发现，与对照组相比，TNF-α处理显著减少了溶菌酶阳性细胞的数量以及Paneth细胞标记物（Lyz1和Defa6）的mRNA表达水平（图4f）。D8改善了TNF-α引起的类器官中或DSS引起的小鼠中的溶菌酶阳性细胞的减少（图4e，g）。
图 4
5、D8在体外和体内上调IL-22的表达
IL-22促进ISC介导的上皮再生。在本研究中，与LPLs共培养时，与对照组相比，D8显着刺激IL-22的分泌，进而促进乳杆菌对肠上皮细胞的保护作用（图5a）。如果模型中没有LPL，D8不能诱导IL-22的分泌（图3c）。有趣的是，TNF-α治疗也增加了IL-22的产生，但是D8通过促进IL-22分泌进一步提高了修复效率（图5a）。此外，添加抗IL-22抑制了D8和IL-22对肠类器官生长（包括表面积，出芽和增殖）的刺激作用（图5b，c）。加入抗IL-22后，D8对TNF-α损伤的肠类器官形态的保护作用也受到抑制（图5d）。结合以上结果，我们发现D8刺激LPL分泌IL-22和肠上皮细胞增殖，从而促进TNF-α引起的损伤的有效恢复。
然而，不同浓度（0.1, 1, 10 mM）的HK-D8和嗜酸乳杆菌ATCC4356以及几种微生物相关分子模式（MAMP），如肽聚糖，磷壁酸，多糖不能显著上调共培养模型中的IL-22表达（图5e，f）。不同浓度（0.1 ,1 ,10mM）的乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐和乳酸也不能。然而，不同浓度（0.1 ,1 ,10 mM）的吲哚-3-甲醛激活AhR，在共培养模型中上调IL-22的表达（图5g）。此外，AhR抑制剂CH-223191可以抑制D8或吲哚-3-甲醛诱导IL-22分泌的作用（图5h）。因为吲哚-3-甲醛是L. reuteri D8的代谢物，进一步证实了D8通过激活AhR诱导IL-22的表达。DSS处理没有降低IL-22的表达，但是D8在DSS处理下进一步增强了IL-22的产生（图5i）。
图 5
6、D8通过分泌IL-22激活pSTAT3信号传导途径
D8处理后促进肠类器官出芽，增加pSTAT3阳性细胞（红色荧光显示）。然而，添加抗IL-22抑制了D8对类器官的刺激作用（图6a）。Western印迹进一步验证该结果（图6b），表明D8通过诱导IL-22的分泌导致肠类器官中STAT3的磷酸化。
与对照组相比，D8处理增加抗微生物肽Reg3b和Reg3g mRNA的相对表达。此外，与TNF-α诱导的类器官损伤相比，D8在病理状态下增强Reg3b和Reg3g表达（图6c）。此外，小鼠的空肠和结肠中Reg3b和Reg3g的表达也增加（图6d）。
图 6
本研究首次报道了乳杆菌促进肠上皮细胞增殖并缓解TNF-α引起的肠道损伤的机制。此外，本研究证明D8通过激活AhR，进而诱导LPL分泌IL-22，随后激活STAT3的磷酸化以加速ISC再生，并恢复TNF-α损伤的肠上皮结构（图7）。
图 7
与其他干细胞不同，ISCs与肠道微生物群共存，这可能会影响上皮细胞的再生。本研究首次报道了乳杆菌对肠道干细胞再生的影响，对相关领域的研究具有很深的启发价值。
本文由莫孞编译，莫秋芬、江舜尧编辑。