科研 | 16S 扩增子测序和宏基因组学等多组学揭示了硝化厌氧氨氧化反应器中群落组装受到运行模式和微生物相互作用影响(国人作品)
编译：Frank，编辑：小菌菌、江舜尧。
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在部分硝化厌氧氨氧化（PNA）反应器中，厌氧氨氧化菌的代谢能力以及相关微生物群落的相互作用因其在废水高效脱氮中的关键作用而受到广泛关注。然而，对于非生物和生物因素如何影响PNA反应器中细菌群落组装的了解尚不全面。
作者利用多组学（高通量16S rRNA测序、宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学）来揭示非生物和生物因素如何影响实验室规模处理合成废水的单级PNA反应器中细菌群落组装。
① 16S rRNA测序结果表明，在接种污泥和处于新稳定状态的污泥中关键自养菌（厌氧氨氧化菌和氨氧化菌）以及相关的异养群落具有不同的相对丰度模式。
② 厌氧氨氧化污泥的Shotgun宏基因组序列，鉴定了58个MAG，其中包括3株厌氧氨氧化菌MAG和3株氨氧化菌MAG。
③ 综合宏基因组、转录组、蛋白质组数据表明，氮代谢是PNA反应器中最活跃的过程。丰富的异养生物有助于自养菌将硝酸盐还原为亚硝酸盐/铵。
④ 基因组和转录组数据表明，在不同细菌组合中，优势异养生物对电子供体的偏好随着厌氧氨氧化细菌的变化而变化，厌氧氨氧化细菌在EPS组成上具有不同的代谢特征。
⑤ 值得注意的是，就氨基酸和维生素的合成而言，反应器中最丰富的异养细菌比丰度较低的异养菌更具营养缺陷性。此外，细菌群落中一株丰度较高的细菌表现出VI型分泌系统的高度转录。
这些发现提供了第一个见解，即PNA反应器中的细菌群落不仅由非生物因素决定，还由代谢性相互作用（氮代谢、电子供体交换和营养缺陷）所影响。
论文ID
原名：Exploring the effects of operational mode and microbial interactions on bacterial community assembly in a one-stage
译名：探索运行模式和微生物相互作用对单级部分硝化厌氧氨氧化反应器中细菌群落组装的影响
期刊：Microbiome
IF：9.86
发表时间：2019.8
通讯作者：张彤
作者单位：香港大学土木工程系环境微生物工程与生物技术实验室
实验设计
1.反应器运行
用日本东北大学的PNA反应器接种厌氧氨氧化生物质，工作容积为1.6升。从连续的单级PNA反应器（历时5年以上）以低DO浓度（0.1-0.8 mg / L）富集了厌氧氨氧化污泥。在缺氧条件下历时40天将CSTR模式调整为SBR操作模式，以恢复脱氮性能。
2. 采样、DNA和RNA提取及测序
为了研究微生物群落结构动力学，在第1天（接种污泥）、19、43、118、134、156、179和187天采集了8份污泥样品，包括启动、退化、恢复和新稳定状态阶段。此外，在第204、210和213天的3个独立反应周期中（图1），从8个采样点中分别取3份样品用于总DNA和RNA提取以及下游基因组回收和转录活性研究。用第1天和第261天的污泥样品进行shotgun测序，以进一步检测微生物群落组成。
3.蛋白质提取、胰蛋白酶消化和质谱分析
从261天的反应周期中获取污泥样品，采样点对应于S1、S3、S4和S6（图1）。使用改良的B-PER法提取总蛋白。根据先前的研究进行了胰蛋白酶消化，用10-μm C18柱对胰蛋白酶消化物进行脱盐，并溶解在0.1％甲酸（v / v）中，在Q Exactive质谱仪（ThermoFisher Scientific Inc.）上进行分析。
4. DNA序列处理
按照质量控制流程，从8个污泥样品中获得clean reads。利用QIIME（v 1.8.0）按98％相似性进行OUT聚类，使用UCLUST 以最小相似度0.9与SILVA数据库注释OTU。合并3个DNA样品（第204、210和213天）产生的宏基因组测序clean reads，以进行质量控制。使用CLC从头组装算法进行clean reads共组装，k-mer为35和最小scaffold长度为1 kbp。使用二维覆盖分箱方法来检索厌氧氨氧化污泥中微生物群落成员的MAGs，使用CheckM检测MAG的完整性。
5. 宏转录组和宏蛋白质组学分析
使用CLC基因组学工作台的读图器，将24个厌氧氨氧化污泥样品中的非rRNA序列映射到共组装重叠群的所有预测ORFs。使用R包edgeR识别好氧-厌氧循环中的差异基因转录，FDR的P值为0.001，差异倍数为2。采用相对基因转录，以找到每个基因组中转录水平相对较高的基因。使用MaxQuant软件中的maxLFQ 算法进行无标记定量（LFQ）。
6. 系统发育分析和MAG注释
使用GTDB数据库和120个细菌特异性保守标记基因的串联集，构建新鉴定的MAG和参考基因组的基因树。首先将所有检索到的MAGs上传到KEGG GhostKOALA进行代谢性状的初步重建，然后上传到IMG-ER系统进行基因组注释。使用HMMER针对dbCAN数据库鉴定了碳水化合物水解酶，根据MEROPS的BLASTP搜索确定了肽酶，使用PSORT预测已鉴定蛋白质的亚细胞位置。
结果
1. 单级PNA反应器的性能
PNA反应器采用连续CSTR操作模式，在开始的75天内观察到了污泥退化。独特的生物反应器设计和污泥混合策略可能会改变厌氧氨氧化污泥的性能并在阶段I引起退化。为了恢复脱氮性能，第40天改为SBR运行模式。经过2个月的恢复（阶段II），平均脱氮率从150.5上升至307.5 mgN / L /天，并在新稳定状态（阶段III）保持保持这一状态。污泥颜色从胭脂红（第1天）变为桃红色（第85天），然后逐渐变为血红色（308天）。在运行约150天后，观察到自聚集的颗粒厌氧污泥，在308天平均颗粒大小达到498 μm。结果表明， PNA反应器中的微生物比接种污泥中的微生物产生更多的胞外聚合物。在第III阶段（第204、210和213天）的宏基因组测序和宏转录组测序的三个反应周期中，好氧阶段的铵盐下降速度快于厌氧阶段（图1）。作为铵氧化产物，亚硝酸盐在反应循环后没有明显积聚，进一步证实PNA反应器中厌氧氨氧化菌在新稳定阶段具有高活性。
图1.用于宏转录组学研究的氮元素在反应周期和采样点上的变化。
2. 细菌群落的演替
16S rRNA测序结果表明，微生物群落发生了显著变化。浮霉菌门的相对丰度在第一阶段出现下降的趋势，然后在第三阶段增加到接种污泥的两倍。占主导地位的厌氧氨氧化菌种由Candidatus Kuenenia变为 Candidatus Brocadia。基于Pearson相关性，相对丰度> 0.3％的OUT分为3类（图2a）。这些细菌群落的模式（增加、减少和过渡增加）进一步表明群落组成的转变以及操作模式的变化。在这两种不同的操作模式中，几乎无法检测到亚硝酸盐氧化细菌（NOB），表明这些操作模式有效地减少了厌氧氨氧化菌和NOB之间亚硝酸盐竞争。
在18个MAG中15个与16S rRNA基因序列具有100％的基因同一性，表明相同的微生物成员从第1天到第261天持续存在。丰度较高的细菌（如AMX1、AOB1、PLA1、ARM1和CFX1）基于基因组的变化与基于16S rRNA的变化具有相似的趋势。与扩增子序列结果相似，根据MAGs的相对丰度分布，在PNA反应器中也发现了细菌群落的变化（图2b）。伴随细菌聚集的AMX3主要在接种污泥中检测到，而在SBR操作约200天后的厌氧氨氧化污泥中几乎检测不到。相反，接种污泥中的低丰度物种在新的细菌群落中占主导地位。除了丰度较高的细菌种群外，在接种和长期操作的厌氧氨氧化污泥中，还鉴定出18个相对物种丰富较低的MAG。从厌氧菌污泥中鉴定了3个厌氧菌MAG和3个氨氧化菌MAG（图3）。这些MAG大多与厌氧氨氧化系统中广泛报道的菌门有关，即变形菌门、拟杆菌门、浮生菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、装甲菌门和疣微菌门。接种污泥和新稳定状态污泥中主要厌氧氨氧化菌亲缘关系的变化与16S rRNA数据观察到的分类学变化一致。新稳定状态最主要的厌氧氨氧化菌（AMX1）与Candidatus Brocadia sp. 40具有99.1％的平均氨基酸同一性，被鉴定为Candidatus Brocadia sp.R4W10303。接种污泥中的优势厌氧氨氧化菌（AMX3）与Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的平均氨基酸同一性为99.5％。Lawson等人在厌氧菌反应器中报道了几种绿弯菌门（CFX1和CFX5）和变形菌门（PRO5）与UTCFX1、UTCFX4和UTPRO2密切相关（图3）。进一步证实在厌氧氨氧化系统中可以广泛地鉴定出与厌氧氨氧化菌相关的生物。
尽管通过改变进料策略可以恢复反应器性能，但操作条件的改变从根本上改变了微生物群落，导致PNA反应器中关键的自养生物和异养生物发生了变化。CSTR操作模式为反应器提供了限制性底物浓度（铵和亚硝酸盐），使接种污泥中AMX3具有优势，而SBR操作模式产生了相对较高的底物浓度。此外，微小污泥颗粒也表明厌氧氨氧化污泥的形式（如絮凝物、生物膜和颗粒剂）对厌氧氨氧化反应器中微生物群落的组装有影响。但是，操作模式的改变也改变了其他参数（如好氧暴露时间和污泥保留时间），这也可能影响微生物群落的组装。此外，优势异养生物的组合转变为与主要自养生物结合，表明生物相互作用也可能有助于细菌的组装。
图 2. 细菌群落组装动力学。a.热图显示至少一半样品中相对丰度> 0.3％的OTU动态。b三元相图显示了三种不同厌氧污泥样品中58种MAG的丰度比较。
图3. 系统分析了来自121个细菌基因组的120个串联蛋白，包括本研究中的58个MAG。在PNA反应器和接种污泥中占主导地位的MAG分别为带有红色和蓝色背景，仅在接种污泥中的独特MAG带有灰色背景，接种污泥中相对丰度<2％且在长期运行的PNA反应器中较少的种群为棕色背景。
3. 氮代谢是PNA反应器中最活跃的过程
图4. 多组学丰度。a，新鉴定的MAG 的相对丰度和时间序列转录。b，已鉴定蛋白质的分类学分布。c，已鉴定蛋白质的代谢途径分布。
图5. 氮代谢涉及的基因和蛋白质表达。a，氮代谢相关途径的总体转录。b，氮代谢相关途径中已鉴定蛋白质的总LFQ强度。c，时间序列厌氧污泥样品中用于氮代谢的特定酶编码基因的平均基因转录。
4. 随着厌氧氨氧化菌的变化，较高丰度异养生物中电子供体的偏好发生变化
在ARM1中鉴定到编码碳水化合物和多糖ABC转运蛋白的基因。在已鉴定的87种ABC转运蛋白中，约28％是该生物体中的碳水化合物转运蛋白，至少145个基因与CAZy数据库中的家族相关，包括编码糖苷水解酶的48个基因。此外，与接种污泥中的异养细菌相比，通过SBR操作模式富集的其他几种生物（如PLA1/2和PRO6）编码的糖苷水解酶基因更多。相反，在接种污泥中占优势的异养菌（CFX1）基因编码许多肽酶和肽转运蛋白。鉴定到外膜金属肽酶编码基因在CFX1、PRO3和PRO4中高表达，表明这些生物是接种污泥中的蛋白质降解菌。Lawson等人报道的关键蛋白降解菌在本研究中尚未发现，进一步表明具有相似生作用的微生物成员的丰度在不同厌氧氨氧化系统中差异很大。CFX1还显示出通过编码和转录脂肪酸降解基因来利用脂肪酸的潜力。结果表明，与SBR操作模式的关键微生物相比，接种污泥中的关键生物对碳源表现出明显的偏好。
5. 营养缺陷型塑造了关键细菌群落的组装
图6. 高丰度细菌中氨基酸和维生素生物合成的相对基因转录。
结论
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