transwell迁移/侵袭实验操作方法

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

迁移实验（cell migration assay）

实验步骤： 

（1）所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育；

（2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105 /ml；

（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培养基，上室加入100－150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24小时；

（4）用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟；

（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中，室温染色15－30分钟；

（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

（7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；

（8）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果

注意事项 

（1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-μm孔径（如AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径；

（2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well，迁移时间12≈36小时；

（3）由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Corning）；

（4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具体可查阅相关文献；

（5）细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；

（6）固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；

（7）Chamber和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；

（8）充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。

细胞侵袭实验 （cell invasion assay） 

操作步骤 

（1）Matrigel在4℃过夜融化；

（2）用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml，冰上操作；

（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel，37℃温育4－5小时使其干成胶状；

（4）后续步骤同迁移实验（1-8）。

注意事项

（1）Matrigel在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷；

（2）铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡；

（3）其他注意事项同迁移试验。