科研 | Science: 受体激酶作用于渠化过程中PIN依赖的生长素转运过程研究
编译：东方不赢，编辑：Emma、江舜尧。
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生长素信号通过植物组织发育或再生中的途径传播，以诱导组织形成。 Hajný研究表明生长素调节受体也可以调节磷酸化，从而调节生长素转运蛋白的亚细胞定位。植物通过这种信号传导途径，生长素建立了运输途径，控制发育。运输生长素自发形成的通道为植物发育的自我组织方面（比如叶脉系统再生或其在叶脉期间的模式）建成提供了位置信息。生长素渠化假说认为生长素信号转导和转运之间存在一个反馈，但具体的调控机制未能鉴定出来。本文中，作者鉴定了控制生长素转运的部分潜在调控机制。生长素调节受体CAMEL（渠化相关生长素调节Malectin类RLK）与CANAR（渠化相关受体类激酶）一起，与生长素转运蛋白PIN相互作用，使其磷酸化。camel和canar突变体在PNI1亚细胞运输和生长素介导的PIN极化都存在缺陷，表型为受伤后叶脉和维管的再生受损。CAMEL-CANAR受体复合物是生长素反馈的组成部分，在生长素渠化过程中协调各个细胞的极化。
论文ID
实验设计
实验结果
1. WRKY23下游存在生长素渠化调节剂
通过DNA微矩阵实验，研究者寻找WRKY DNA结合蛋白23（WRKY23下游的）转录因子（TF）基因，该基因调节植物生长素介导的PIN复极化，获得了14个基因作为生长素诱导型WRKY23的潜在目标基因（图1A）。为了在其中识别生长素渠化的调节剂，研究者使用相应功能丧失的突变体，分析了叶片发育过程中维管系统的形成，该发育过程对依赖PIN的生长素转运反馈调节。通常，野生型子叶会像大多数突变体一样形成四个环的保守模式，但AT5G40780和AT1G05700中的突变体除外，观察到了明显的脉络缺陷。
因此，研究者确定了AT5G40780和AT1G05700在TIR1 / AFB-WRKY23的下游起作用，并且是基于渠化的过程（例如叶脉）所必需的。
图1 CAMEL表达受WRKY23调控，并取决于TIR1 / AFB途径
（A）微阵列实验以识别TIR1 / AFB-WRKY23信号传导模块下游的生长素调节基因。（B）可能的CANAR相互作用子的胞外域之间的物理相互作用图。（C）CAMEL和CANAR的域组织的示意图。定量RT-PCR实验表明（D）CAMEL表达取决于WRKY23，（E）生长素介导的CAMEL上调需要TIR1 / AFB活性。（F）烟草中的萤光素酶测定。35S :: WRKY23与CAMELpro：LUC共表达，分别显示35S：WRKY23或CAMEL：LUC的阴性对照。（G和H）在原生质体中瞬时表达的35S :: CANAR-GFP和35S :: CAMEL-mCherry的FRET-FLIM分析。如补充材料，材料和方法中所述计算GFP荧光寿命，热图表示荧光寿命值。
2. 生长素信号传导下游的Malectin型LRR受体样激酶CAMEL
AT1G05700编码来自亚家族I的富含亮氨酸的重复序列（LRR）受体样激酶（RLK）家族成员，细胞外区域由一个大的Malectin型结构域和三个LRR重复序列组成（图1C），研究者将AT1G05700命名为“ CAMEL”。
35S ::WRKY23-GR和35S ::WRKY23-SRDX的RT-PCR证实，CAMEL在激活WRKY23后，mRNA的数量增加，在其抑制后，mRNA的数量减少（图1D）。JASPAR数据库TF预测得到，WRKY23是与CAMEL启动子结合的最佳候选基因之一。使用基于烟草的荧光素酶表达系统发现WRKY23激活了CAMELpro。35S :: WRKY23和CAMELpro :: LUC的共表达导致萤光素酶活性升高（图1F）。以上论据支持CAMEL是WRKY23的下游基因这个结论。
生长素介导的PIN极性重排和基于渠化的系统发育需要TIR1 / AFB生长素途径，WRKY23在此过程中发挥重要作用。本实验验证了这一点，生长素以时间和剂量依赖性方式诱导了类似于WRKY23的CAMEL转录，并且在35S:: WRKY23-SRDX在生长素信号转导中有缺陷的突变体中，未观察到这种生长素作用（图1，D和E）。此外，CAMELpro包含六个植物生长素响应元件，表明可能需要直接通过植物生长素响应因子（ARF）进行其他植物生长素调节，同时支持植物生长素对CAMEL的快速上调。
因此，CAMEL在TIR1 / AFB-ARF信号模块的下游受到WRKY23的转录调控。
3. CAMEL-CANAR信号复合物作用于细胞表面
研究者使用了拟南芥LRR-RLKs胞外域物理相互作用图谱来鉴定与CAMEL相互作用的其他受体样激酶。大型VII类LRR-RLK被作为单个高可信度的相互作用酶进行检索（图1，B和C）。因为其在渠化过程中与CAMEL相关联，研究者将其命名为“ CANAR”。
首先研究者用GFP抗体免疫沉淀CANAR-绿色荧光蛋白（GFP），进行串联质谱分析，获得了包含可能的交互因子的列表，前10个中包括CAMEL。接下来，在烟草中使用双分子荧光互补（BiFC）测试了CAMEL-CANAR相互作用。CAMEL和CANAR的共渗在两种组合中均产生正信号，阴性对照没有显示信号（图S1）。研究者使用Förster共振能量转移结合荧光寿命成像显微镜（FRET-FLIM）定量地测试CAMEL-CANAR相互作用。在拟南芥根原生质体中共表达了35S ::CANAR-GFP和35S :: CAMEL-mCherry，并与单独表达的35S :: CANAR-GFP相比，GFP荧光寿命缩短了（图1，G和H）。生长素处理对CAMEL-CANAR相互作用没有影响。FRET-FLIM实验的空间分辨率表明，这两种蛋白质都已定位并在细胞表面形成复合物（图1G）。
4. 叶脉系统中的CAMEL和CANAR
接下来研究者在camel-1/-2和canar-1/-2这两个基因中分离了T-DNA插入功能丧失突变体，并获得了在组成型RPS5A和35S启动子下过表达CAMEL和CANAR的功能转基因株系（图S2，E和F）。camel-1和-2突变体显示出异常的叶脉模式，上部环断开，多余的分支以及多余或缺失的环路。两个过表达株系也表现出维管系统缺陷，尽管出现频率较低（图2，A和B）。canar-1和-2突变等位基因均显示相似，为更明显的维管系统异常，而35S :: CANAR-GFP总体上显示出较不常见的缺陷（图2C和D）。双突变camel-1xcanar-1表现出恢复性脉络，说明CAMEL和CANAR可能具有拮抗作用（图2，A和C，以及图S2G）。由于未观察到其他明显的生长缺陷，CAMEL / CANAR功能似乎对维管系统特异。
图2 camel和canar突变体叶脉形成时的异常模式和PIN1极化
（A和C）（A）camel-1或（C）canar-1的子叶中叶脉纹路缺陷的代表图像。（B和D）量化camel和canar突变体中的叶脉缺陷（每种基因型n> 75）。（E）camel-1 / canar-1突变体子叶中的DR5rev :: GFP信号分布和（F）强度。（G和H）Col-0中的PIN1极性一致，而camel-1 / canar-1突变体的PIN1极性缺陷。（G）中的彩色框表示（H）中特写的位置。（H）在第一片叶子中PIN1免疫定位的代表性图像。左上角的数字表示所观察到的PIN1极性缺陷与所分析的叶片总数比例。白色箭头表示典型的PIN1极性定位。红色箭头指示PIN1极性缺失。
研究者接下来分析了生长素反应性报告基因DR5rev :: GFP的表达，发现可能与生长素的分布有关。在camel-1和canar-1突变体中，DR5活性均比对照降低（图2，E和F）。当分析下胚轴中基部（向根）生长素的运输时，观察到camel-1和canar-1突变体生长素的流动均减少。由于表达PIN1的极化通道的形成与叶脉的形成有关，研究者通过用PIN1抗体染色的方法检查了初生幼叶中PIN1的极性。在野生小叶中，观察到PIN1极性限定了生长素运输通道，在初级和次级分支中具有罕见的PIN1极性异常。相比之下，camel-1和canar-1突变体均在初级分支中出现了PIN1极性缺陷（图2H，红色箭头），次要分支中也出现了较高的PIN1极性缺陷（图2，G和H），而没有缺陷在中脉中观察到任何测试的基因型（图S2R）。
这些观察结果表明，CAMEL和CANAR调节叶脉期间的维管系统发育，并在此过程中协调PIN1极性。
5. CAMEL和CANAR在植物受损后叶脉再生中的作用
渠化介导过程的另一个经典示例是伤口形成后新叶脉的再生，研究者水平切断了拟南芥花序茎中的维管系统（图3A），并在受伤后1至7天分析了GUS表达。CAMEL和CANAR以及WRKY23在再生过程中均显示启动子活性（图3B和图S3A）。接下来分析了功能丧失的突变体中的维管系统再生的程度，并通过甲苯胺蓝（TBO）染色观察了过表达株系的维管系统再生。在野生型中，维管系统已完全发育，并且可见染成蓝色的新导管细胞（图3C，白色星号）和木质化细胞（图3C，红色星号）。所有突变体均由于无法形成再生连续的细胞而导致再生不良。RPS5A :: CAMEL出现的缺陷较少，而35S :: CANAR-GFP的再生甚至优于野生型（图3，C和D，以及图S3，B和C）。同时观察到生长素运输通道不能灵活的形成。在PIN1-GFP中可以绕开伤口形成了PIN1-GFP表达通道，但在canar-1xPIN1-GFP中则没有（图S3D，黄色箭头）。camel-1xcanar-1双重突变体显示出与单个突变体相同的再生缺陷（图S3，B和C）。
图3 camel，canar和wrky23-1突变体损伤后叶脉系统再生不良
（A）用于分析受伤后叶脉系统再生的实验方案。（B）受伤后4天，CANARpro::GUS，CAMELpro::GUS和WRKY23pro::GUS的表达。伤口部位用白色箭头指示。比例尺，100μm。（C）在受伤（DAW）后0和7天，canar-1，camel-1和wrky23-1突变体和RPS5A:: CAMEL过表达植株的茎受伤。茎用甲苯胺蓝染色以可视化再生导管细胞（白色星号）和木质化实质细胞（红色星号）。伤口部位用白色箭头指示。（D）量化（C）中的再生缺陷。n表示评估植物的数量。
研究者局部使用外源植物生长素来直接分析植物生长素介导的植物生长素运输通道的形成。在伤口下方的茎侧上应用IAA小滴（洋红色标记）使PIN1表达通道形成，该通道在野生型受伤后2天就已经与先前存在的叶脉系统相连，即使在受伤4天后，也无法在canar-1背景中观察到这种效果（图S3E）。因此，只有在野生型中才能观察到相似的新形成的叶脉组织（如TBO染色所示）（图S3F）。
这些结果揭示了CAMEL和CANAR以及它们的上游调节剂WRKY23在受伤后叶脉维管系统的可变再生中的作用。
6. CAMEL和CANAR在植物生长素转运蛋白PIN的运输和极性中的应用
因为PIN极性的生长素反馈是渠化的主要特征之一，并且PIN极性的定位与其组成型胞吞循环有关，研究者测试了CAMEL和CANAR是否参与了这些过程。抑制剂BFA处理后，PIN胞吞循环可以通过PIN细胞内聚集可视化。根部的抗PIN1免疫染色表明，经BFA处理后，camel-1和canar-1突变体的PIN1细胞内聚集减少（图4，A和B）。在camel-1xPIN2-GFP和canar-1xPIN2-GFP杂交中观察到了相同的现象（图S4，A和B），表明PIN胞吞再循环存在缺陷。
图4 在camel和canar突变体中，PIN极性的亚细胞运输和生长素反馈受到损害
（A）在wt，camel-1和canar-1中对PIN1进行免疫染色后，主根石细胞的共聚焦图像。幼苗经BFA处理（25μM）30分钟。（B）（A）的定量评估显示了BFA体的总数/每根细胞总数的比率。（C）10μM NAA处理4小时后，PIN1在根分生组织内膜中的免疫定位。（D）（C）的定量评估显示了内胚层细胞中PIN1横向与基础信号强度比率的平均比率。
生长素对PIN极性的影响可以通过将PIN1从根部内胚层细胞中的基底侧向内侧面重新极化来估算。抗PIN1的免疫定位表明，在生长素处理后，camel和canar突变体的PIN1复极作用降低（图4，C和D，以及图S4，C至E）。
这些结果表明，CAMEL-CANAR复合物不仅在器官和组织水平上与渠化相关的发育中起作用，而且还靶向作用于单个细胞中的PIN1，调节其亚细胞运输和有关PIN极性的生长素反馈。
7. CAMEL-CANAR受体复合物靶向并磷酸化PIN植物生长素转运蛋白
为了深入了解CAMEL-CANAR作用机理和下游过程，研究者从幼苗中免疫沉淀了CAMEL-GFP以鉴定CAMEL的相互作用组。通过质谱分析共免疫沉淀的蛋白质（表S4）。在可能相互作用因子列表中，发现了多种PIN蛋白。
研究者为了确认与PIN1的相互作用，在拟南芥根原生质体中瞬时共表达35S :: CAMEL-GFP + 35S :: PIN1-mRFP和35S ::CANAR-GFP + 35S :: PIN1-mRFP。PIN1-mRFP与CANAR-GFP和CAMEL-GFP共同免疫沉淀（图5A）。此外，他们在表达35S::CAMEL-GFP或35S::CANAR-GFP的根原生质体中进行了FRET-FLIM。与35S::PIN1HL-mCherry（HL，亲水环）共表达后，CAMEL-GFP和CANAR-GFP的寿命缩短，进一步证实了CAMEL/CANAR与PIN1之间的相互作用（图5，B和C）。
图5 CAMEL-CANAR信令靶向定位于PIN1
（A）来自拟南芥根原生质体的免疫共沉淀。通过抗体-GFP珠共免疫沉淀CAMEL-PIN1和CANAR-PIN1的蛋白质复合物。抗AHA2的抗体用作上样对照。（B和C）在原生质体中瞬时表达的35S::CAMEL-GFP和35S::CANAR-GFP与35S::PIN1HL-mCherry（HL，亲水环）的FRET-FLIM分析。（D）通过CAMELCD（CD，细胞质结构域）的PIN1/2/3HL的体外激酶磷酸化测定的放射自显影。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离样品的等分试样，并进行放射自显影。将考马斯亮蓝用作装载对照并表明各个重组蛋白的存在。
研究者测试了CAMEL和CANAR磷酸化PIN的能力，来观察两者是否作为激酶来调节PIN活性和极性定位调节模式。研究者通过将纯化的PIN1HL, PIN2HL, PIN3HL与CAMEL和CANAR的纯化的胞质激酶结构域与ATP进行孵育，进行了体外激酶测定，检测到了CAMEL对PIN环的磷酸化作用，其中PIN1HL是最好的底物（图5D）。但是，CANAR没有显示激酶活性（图S5A）。跟其他已知的假激酶失活一样，可以通过从催化核心中保守的HRD基序中丢失天冬氨酸来解释缺乏激酶活性的原因。
考虑到缺少CANAR激酶活性，组成型CAMEL-CANAR相互作用以及camel-1xcanar-1双突变体的叶片叶脉系统缺陷的互补性，研究者认为CANAR可能是CAMEL的负调控因子。CANAR激酶结构域减少来减少CAMEL自身磷酸化作用和针对的激酶活性证明了这一点（图S5C）。
使用质谱分析了体外激酶反应来测试CAMEL介导的PIN1磷酸化的相关性，并在PIN1HL中鉴定了五个最保守的推定磷酸位点（图6，A至C，以及图S5D）。这些位点可能不同，它们未被有关激酶磷酸化PIN环（例如PID / WAG，D6PK或MPK）的研究提及（图S5D），并且当它们突变后，它们降低了CAMEL激酶域磷酸化PIN1HL的能力（图S6，A和B）。
图6 PIN1胞质环中靶向CAMEL的磷酸位对于PIN极性和脉序至关重要
（A）质膜中PIN1的示意图，CAMEL靶向的细胞质环中的磷酸位明显位置。（B）35天大的PIN1pro :: PIN1-GFPT3AS2A和PIN1pro :: PIN1-GFPT3ES2E的表型。（C）根分生组织内胚层细胞中PIN1-GFP，PIN1-GFPT3AS2A和PIN1-GFPT3ES2E的亚细胞定位。白色箭头指示主要的亚细胞定位。（D）PIN1pro :: PIN1-GFP，PIN1pro :: PIN1-GFPT3ES2E的子叶中脉序系统表型的代表性图像。（E）定量PIN1pro :: PIN1-GFP，PIN1pro :: PIN1-GFPT3AS2A（A，B和F）和PIN1pro ::PIN1-GFPT3ES2E（第13行）中的脉序系统缺陷（每种基因型的n> 68）。评分类别为正常脉序系统，较少的环路，较高的结构（包括额外的环路或分支）和较多的断开连接。（F）（图S6D）的定量评估显示了内胚层细胞中PIN1-GFP信号的平均顶端到底端比率。
研究者通过分别将三个苏氨酸和两个丝氨酸分别置换为丙氨酸或谷氨酸，生成了磷酸化的PIN1-GFPT3AS2A和磷酸化的PIN1-GFPT3ES2E载体，将其置于天然PIN1启动子的控制之下，并将其引入野生型植物。两种构建体均表达GFP的阳性转化子已在第一代花序茎中表现（PIN1-GFPT3AS2A为20个中的7个，PIN1-GFPT3ES2E为18个中的18个），表明可能是pin1功能丧失（图6B）。其他阳性植物没有表现出很强的表型通过种子可以在F1中进行分析。PIN1-GFPT3AS2A和PIN1-GFPT3ES2E系子叶的脉序均显示出叶脉异常的发生率增加（图6，D和E，以及图S6C）。PIN1T3AS2A（4个中的4个）和PIN1T3ES2E（2个中的2个）的第一代所有阳性转化子均显示裸露的花序茎在受伤后未显示脉序系统再生，其特征是导管细胞破碎，海绵细胞无实质性连接或形成在伤口上愈伤组织（图S6E）。为了测试所鉴定的磷酸位点在渠化中的作用，研究者测试了生长素对PIN1突变的影响。PIN1-GFP主要位于根部，而PIN1-GFPT3AS2A和PIN1-GFPT3ES2E都显示出更多的非极性定位（图6C和图S6D）。当用针对GFP的抗体进行免疫定位时，在模拟情况下已经部分极化至内侧的PIN1-GFPT3AS2A和PIN1-GFPT3ES2E，在生长素应用后均未显示任何进一步的极性变化（图6F和图S6D）。
CAMEL-CANAR复合物与PIN相互作用，CAMEL能够磷酸化其胞质环。PIN1环中的磷酸化和致死突变的影响，支持了磷酸化，生长素运输与生长素通道化的相关性。与camel/ canar突变体相比，携带突变的CAMEL靶向磷酸化位点的PIN1的株系中较强的缺陷表明，控制生长素转运的激酶的这些磷酸位点在不同的发育环境中都存在。
讨论
研究者在这篇文章中提出了一个生长素如何控制其自身定向细胞间运输的机制学说，并确定了生长素渠化机制的分子成分，该机制基于生长素通道的可变性和自组织形成，指导了脉序系统的形成。转录生长素信号转导下游的CAMEL-CANAR复合物的鉴定及其对PIN依赖性植物生长素转运的直接调节，为整体调节植物生长素短程调节信号，进一步协调植物体内的细胞极性进行适应性生长提供了潜在的手段。