科研 | Ann. Rheum.Dis.:通过蛋白质组学，生物力学和功能分析明确了系统性红斑狼疮中性粒细胞的异质性
编译：周仙杰，编辑：Emma、江舜尧。
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低密度粒细胞（LDG）是系统性红斑狼疮（SLE）中扩展的促炎性和血管损伤性中性粒细胞的一个独特亚群，中性粒细胞的运输及免疫功能与细胞的生物物理特性密切相关。本研究使用蛋白质组学，生物力学和功能分析进一步明确了SLE的中性粒细胞异质性，通过蛋白质组学/磷酸化蛋白质组学分析健康对照（HC）正常密度中性粒细胞（NDNs）和SLE的NDNs及其LDGs，并通过实时变形细胞计数和格栏光片显微镜分析这些中性粒细胞亚群的生物物理特性。采用二维内皮流动系统和三维微流体微脉管系统模拟（MMM）分别解析细胞表面介质和生物物理特性对中性粒细胞转运的影响。系统性红斑狼疮（SLE）受试者与健康对照（HC）中性粒细胞的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学具有差异，且SLE NDNs与SLE LDGs的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学也具有差异。与SLE NDNs相比，SLE LDGs中1型干扰素调节蛋白的丰度增加，并且细胞骨架功能相关的蛋白质的磷酸化具有差异。与SLE NDNs和HC NDNs比较，SLE LDGs的细胞表面粗糙，提示存在膜扰动。虽然SLE LDGs在二维测定中未表现出与内皮细胞的结合增加，但它们在肺MMM的狭窄通道中滞留/捕获增加。本研究观察到SLE的中性粒细胞蛋白质组和生物物理特性明显改变，中性粒细胞的运输也与健康对照具有差异。在狼疮器官损害和小血管脉管病变的背景下，SLE LDGs越来越多地滞留在微脉管网络中具有重要的致病意义。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 红斑狼疮和健康对照中性粒细胞差异蛋白谱
蛋白组学/磷酸化蛋白组学分析系统性红斑狼疮组的低密度粒细胞和正常密度中性粒细胞(NDNs)以及健康对照（HC）的NDNs（每组5例样本）。考虑到使用N-甲酰基甲硫氨酸亮氨酰苯丙氨酸（fMLF）会降低HC NDNs密度，因此对fMLF致敏后的HC NDNs也进行了分析。为了将全血中未受刺激的细胞的生物物理或功能破坏降至最低，中性粒细胞的制备采用相同方案进行优化。
中性粒细胞质谱分析鉴定出4109种蛋白质（图1A），其中有601种（14.6％）仅在HC中性粒细胞中鉴定出，而685种（16.6％）仅在SLE中性粒细胞中鉴定出，这可与先前报道的最全面的中性粒细胞蛋白质组学分析相媲美。将鉴定结果与SLE LDGs、NDNs和HC NDNs的转录组（GEO GSE139358）进行比对，以确定mRNA水平上不存在的可能是外源性来源的蛋白。虽然SLE LDGs和NDNs的蛋白质组完全重叠，但蛋白质丰度差异较大，与SLE NDNs相比，SLE LDGs中有270种蛋白丰度增加，60种蛋白丰度降低，丰度具有差异的蛋白约占SLE中性粒细胞表达蛋白质的9.4％（图1C）。SLE NDNs和HC NDNs共有的蛋白质有2823种，其中304种（10.7％）蛋白质丰度不同。与未致敏的HC NDNs相比，fMLF致敏的HCNDNs除了L-选择蛋白丰度降低外，蛋白质组完全重叠，蛋白丰度几乎没有变化，这表明蛋白质在体外激活中脱落。总体而言，许多蛋白质在HC或SLE中性粒细胞中独特存在，并且不同亚群的蛋白质丰度不同，表明中性粒细胞蛋白质组异质性。
在中性粒细胞中，本文鉴定出875种在丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基上磷酸化的蛋白质（图1B），其中一些蛋白质在多个位点被磷酸化。这些磷酸化蛋白质，仅在HC NDNs中鉴定出的蛋白质有48种（5.4％），仅在SLE中性粒细胞中鉴定出的蛋白质有366种（41.8％），所有中性粒细胞共有的460种磷酸化蛋白质中HC NDNs与SLE NDNs有100种（21.7％）磷酸化蛋白丰度不同。fMLF致敏和未致敏的HC NDNs中共表达的磷酸化蛋白有509种，其中有167种（32.8％）磷酸化蛋白丰度不同。与SLE NDNs比较，SLE LDGs中有95种磷酸化蛋白（11.5％）丰度改变，其中11种磷酸化蛋白丰度降低，84种磷酸化蛋白丰度增加（图1D），此外，在SLE LDGs中鉴定出一种独特的磷酸化蛋白，磷酸化圆形精子细胞碱性蛋白1样蛋白（pRSBN1L），这些数据均支持中性粒细胞磷酸化蛋白质组的异质性。
图1 系统性红斑狼疮（SLE）正常密度中性粒细胞（NDNs）与健康对照组（HC）NDNs相比，蛋白质组和磷酸化蛋白质组不同
质谱分析共鉴定出，SLE（n = 5）低密度粒细胞（LDGs）和NDNs与HC（n=5）未致敏和致敏的NDNs中（A）4109种蛋白质（B）875种磷酸化蛋白。火山图描述了SLE NDN和LDG差异蛋白质组（C）和磷酸化蛋白质组（D）。LDGs中上调（红色）和下调（绿色）的蛋白质组，NDNs是参考蛋白质组。（E）基因本体论生物学过程分析突出了与蛋白质相关的生物网络，与HC NDNs比较，SLE NDN样品中蛋白质更为丰富。（F）与HC NDNs比较，SLE NDNs中与中性粒细胞活化相关的蛋白质上调。（G）相对于SLE LDGs，SLENDNs和HC NDNs中干扰素诱导蛋白的相对丰度。热图中的空心框表示样品中未鉴定出的已知蛋白质。（H）相对于自身的SLE LDGs和自身致敏的HC NDNs，SLE NDNs和HCNDNs中细胞整联蛋白和粘附相关蛋白的丰度。（I）所有中性粒细胞亚群中，与调节中性粒细胞-内皮相互作用相关的磷酸化蛋白质丰度。使用Kruskal-Wallis检验与事后Dunn检验进行多重比较。所有结果均以平均值±标准误表示，并且显著性设定，*p≤0.05，**p≤0.01，ns＝不显著。
2. LDG蛋白质组的不同特征
使用ShinyGO和MetaScape，将丰度具有差异的蛋白质与已知的基因本体生物学进程相匹配。与HC NDNs相比，SLE NDNs中丰度升高的蛋白质涉及中性粒细胞活化网络，并且一些与中性粒细胞活化相关的蛋白质在SLE LDG中最为丰富（图1E，F）。
SLE受试者的多种器官和细胞，包括NDNs和LDGs，高表达1型IFN刺激基因（ISG），与HC NDNs比较，SLE NDNs中ISG编码蛋白没有一致上调，但与SLE NDNs和HC NDNs比较，SLE LDG中多数ISG编码蛋白上调（图1G）。ISG转录是由信号转导因子和转录激活因子（STAT）的磷酸化介导的，但本文未检测到磷酸化STATs，这可能是因为pTyr残基没有pSer丰富，有限的LDG数量阻止了pTyr残基的免疫沉淀以及磷酸肽的富集。总体而言，SLE中性粒细胞蛋白质组表明，激活状态下，SLE LDGs的IFN相关蛋白特征是不同的。
中性粒细胞的致敏/激活可促进其与内皮细胞的相互作用，本研究结果显示中性粒细胞不同亚群的粘附分子或整合素表达没有差异，但fMLF致敏的HC NDNs比其他中性粒细胞亚群，调节中性粒细胞-内皮相互作用的磷酸化蛋白丰度更高（图1H，I），这表明SLE LDGs/NDNs与fMLF致敏的HC NDNs之间存在差异。
与HC NDNs比较，SLENDNs中差异磷酸化蛋白与细胞器组织及肌动蛋白细胞骨架组织有关，包括磷酸冠蛋白1A（pCORO1A）和磷酸热休克蛋白90AA1（pHSP90AA1）。SLE LDGs中与中性粒细胞脱颗粒相关的某些蛋白质丰度较SLE NDNs中低，但包括髓过氧化物酶和组织蛋白酶G在内的关键颗粒蛋白并未减少（图2A，B）。准确的说，低丰度的膜蛋白，尤其是富含纤维凝胶蛋白1的颗粒膜蛋白，解释了SLE LDGs中脱颗粒相关网络的下调，但脱颗粒能力的差异不能解释中性粒细胞亚群间的蛋白质组的变化。
与SLE NDNs比较，SLE LDGs中丰度高的蛋白质，主要与中性粒细胞活化、凝血、血小板和细胞内运输网络相关（图2C）。与自身NDNs相比，SLELDGs中的SLE生物学网络上调，主要由补体蛋白驱动（图2D），且免疫球蛋白和载脂蛋白丰富。此外，SLE LDGs与SLENDNs的差异磷酸化蛋白也与中性粒细胞活化和细胞内运输有关，且SLE LDGs表达的核糖体蛋白丰度更高（图2E-G）。
SLE LDGs是一个异质性群体，包含CD10-（未成熟，丰度较低）和CD10+（中等成熟，丰度最高）亚群，与SLE NDNs和CD10+ LDGs比较，CD10- LDGs的CEBPD和SPI1转录物减少。未分离的SLE LDGs的蛋白质组学分析显示，不同中性粒细胞亚群具有相似的SPI1蛋白丰度，在HC NDNs中未鉴定出CEBPD，但CEBPD在SLE LDGs和NDNs中相似（图2H）。大多数SLE LDGs具有多叶核，这表明中等成熟的细胞是LDG亚群中最丰富的。
图2 系统性红斑狼疮（SLE）低密度粒细胞（LDG）具有独特的蛋白质组学特征，其特征是与翻译活性、细胞内运输和I型干扰素诱导的蛋白途径相关通路增强。
（A）基因本体论生物学过程分析，与SLE正常密度中性粒细胞（NDNs; n = 5）相比，SLE LDGs（n = 5）中丰度较低的蛋白质相关生物学网络。（B）相对于SLE LDGs，SLE NDNs和健康对照（HC）NDNs中脱颗粒网络相关蛋白的相对丰度。（C）基因本体论生物学过程分析，与SLE NDNs比较，SLE LDGs样品中丰度较高的蛋白质相关生物学网络。（D）与SLE LDGs比较，SLE NDNs和HCNDNs中SLE网络相关蛋白的相对丰度。（E）与SLE LDGs比较，SLE NDNs和HCNDNs中与真核翻译网络相关蛋白质的相对丰度。热图中的空心框表示样品中未鉴定出的已知蛋白质。（F）与SLE LDGs比较，SLE NDNs和HCNDNs中凝血及与血小板网络相关蛋白的相对丰度。（G）基因本体论生物学过程分析，SLE LDGs与SLE NDNs差异磷酸化蛋白相关的生物学网络。（H）转录因子CEBPD和SPI1的丰度，HC NDNs中未鉴定出CEBPD。使用Kruskal-Wallis检验与事后Dunn检验进行多重比较。所有结果均以平均值±标准误表示，并且显著性设定， *p≤0.05，ns=不显著，N.F.＝未发现。
3. SLE LDGs和NDNs的细胞骨架相关蛋白表达不同
与自身NDNs比较，SLE LDGs中与细胞骨架功能相关的蛋白质水平上调（图3A），这与SLE LDGs中细胞骨架相关转录网络增强的结果一致，并且SLE LDGs中差异表达和/或磷酸化的许多蛋白质具有调节细胞内运输的功能（图3B，C）。通过评估fMLF对HC NDN磷酸化蛋白质组的调节作用，本研究发现未致敏和fMLF致敏的HC NDNs中差异磷酸化蛋白质与细胞骨架组织相关（图3D，E）。SLE LDG蛋白质组中细胞骨架相关网络的上调和磷酸化蛋白质组学结果提示不同中性粒细胞亚群间细胞骨架重组具有差异，促使本文对中性粒细胞生物力学特性的研究。
图3 蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析表明系统性红斑狼疮（SLE）正常密度中性粒细胞（NDNs）和低密度粒细胞（LDGs）之间与细胞骨架功能相关的蛋白质的表达具有差异
（A）基因本体论生物学过程分析，与SLE NDNs比较，SLE LDGs样品中与细胞骨架功能相关的蛋白质丰度更高。（B）与SLE LDGs比较，SLENDNs和HC NDNs中细胞骨架相关蛋白的丰度。热图中的空心框表示样品中未鉴定出的已知蛋白质。（C）与SLE NDNs比较，SLELDGs中与细胞骨架网络相关的磷酸化蛋白质的丰度。（D）基因本体论生物学过程分析，致敏（n = 5）与未致敏（n = 5）的HCNDNs中差异磷酸化蛋白质相关的生物网络。（E）与自身HC NDNs比较，致敏的HC NDNs中调节细胞骨架的磷酸化蛋白的丰度。
4. 临床上活跃期SLE的中性粒细胞生物力学特性发生改变
实时变形细胞术（RT-DC）是一种高通量技术，可分析悬浮液中成千上万个细胞的生物力学特性，带有高速摄像的倒置显微镜能够捕捉单个细胞通过PDMS微流控芯片狭窄收缩通道的图像，细胞在狭窄通道中受到流体动力剪切应力而变形，细胞追踪算法会生成每个细胞的生物力学特征，包括细胞大小（横截面积）、粗糙度（通过凸起面积除以横截面积来量化细胞表面扰动）和可变形性（1减去收缩通道内的圆度值），通过细胞大小和亮度来区分血液中的细胞群（图4A）。使用上述方法检测HC（n = 11）、临床静息（n =11）或临床活跃的SLE（n = 4）外周血中性粒细胞的生物力学特性，在某些实验中将fMLF直接添加到HC外周血中以致敏中性粒细胞。来自HC和临床上静息的SLE的中性粒细胞在生物力学上是相同的，而活跃的SLE中性粒细胞具有更大的面积、可变形性且粗糙度增强。与未致敏的中性粒细胞相比，fMLF致敏的HC中性粒细胞更大、更易变形，并且明显更粗糙（图4B）。总体而言，来自活跃SLE受试者的中性粒细胞生物力学特性和细胞膜扰动改变。
图4 实时变形细胞术（RT-DC）检测结果显示，系统性红斑狼疮（SLE）低密度粒细胞（LDGs）在生物力学上比其他中性粒细胞亚群更粗糙
（A）RT-DC用于生物力学表征中性粒细胞亚群的形状、大小和可变形性。（B）使用RT-DC分析健康志愿者（n = 12）、临床上静息的SLE患者（n = 9）和活跃性的SLE患者（n = 4）血液样本的中性粒细胞的生物力学谱。某些情况下，使用100nM N-甲酰基甲硫氨酸亮氨酰-苯丙氨酸（fMLF）致敏健康人血液中的中性粒细胞。（C）使用RT-DC鉴定SLE（n = 6）和健康对照（HC）外周血单核细胞（PBMCs；n=6）中LDGs的百分比。（D）SLE患者（n = 6），HC志愿者（n = 6）和fMLF致敏的HC（n = 6）血液中LDGs占总中性粒细胞的百分比。（E）使用RT-DC分析HC志愿者（n = 11）和临床静息期SLE患者（n=11）的NDNs和LDGs的生物力学谱。显著性设定为*p≤0.05，**p≤0.01，ns ＝不显著。（F）RT-DC捕获的NDNs和LDGs图像，来自SLE患者（n=11）和HC志愿者（n=11）每个中性粒细胞亚群的图像（10倍物镜，>500张）。白色箭头表示致敏的HC NDNs中常见的凹形细胞表面特征，以及SLE LDGs中常见的细胞表面的不规则突起。（G）显微镜明场观察的NDNs和LDGs（n=3）。白色箭头表示在致敏的HC NDNs（约100％）中观察到的圆形、凸起的膜特征和在SLE LDGs(约30％)中观察到的不规则凸起。
5. SLE LDGs和NDNs在生物力学上是不同的
定量纯化临床静息受试者SLE LDGs/NDNs和HC NDNs的生物力学特性，为避免破坏生物力学特性本研究优化了纯化方法，门的设置可以鉴别混合细胞中的中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞（图4A）。SLE和HC受试者的淋巴细胞和单核细胞的生物力学特性没有差异，但与其他中性粒细胞亚群相比，SLE LDGs具有独特的生物力学特征（图4E），HC和SLE NDNs呈圆形且光滑，但SLELDGs的细胞表面明显较粗糙，这与年龄相关，与其他临床/人口统计学特征无关。使用Sm/RNP免疫复合物和/或重组IFN-α在多个时间点孵育HC NDNs，中性粒细胞粗糙度没有变化。综上所述，SLE LDGs表现出独特的生物力学特性，且可能与免疫复合物或I型IFNs的暴露无关。
SLE PBMC中的中性粒细胞百分比高于HC（图4C，D），这可能由于LDG的数量较高的，但目前尚不清楚SLE中的LDGs是否由健康个体中少量存在的LDGs扩增而来。本研究比较了SLE LDGs和少量HC LDGs的生物力学特性，HC LDGs具有光滑的非极化表面，与自体HC NDNs相似，与SLE LDGs的生物力学表型不同，此外HC LDGs比HC NDNs更易变形（图5C），这些生物力学性质的差异表明SLE LDGs不是HC中少量LDG群体的扩增。
fMLF致敏的HC NDNs在形态上更粗糙，在密度梯度上位于PBMC相间（图4D），并且它们比自体未致敏的NDNs大。相对而言，SLE LDGs的大小与自体SLE NDNs相似（图4E），这表明致敏的HC NDNs和SLE LDGs在生物力学上是不同的，生物力学的差异已通过明场（图4F，G）和格栏光片荧光显微镜观察得到了证实。fMLF致敏的HC NDNs的细胞表面出现皱褶，小薄膜扰动向内和向外移动。相反，除了不规则形状剧烈突起的部分，SLE LDGs的细胞表面是光滑的（图4F，G），这表明SLE LDGs具有与急性致敏表型不一致的独特的生物物理特性。
6. SLE LDGs在微流体微脉管系统模拟物（MMM）中滞留
中性粒细胞的生物力学特性可以调节经肺微血管的转运，致敏的中性粒细胞滞留在肺毛细血管床中，可能是由于细胞刚度增强和/或细胞形状不规则。为了模拟经肺微血管的运输，本文开发了由PDMS芯片内的分支锥体网络组成的MMM（图5A），中性粒细胞在生理相关的压力（分别为10和50 mbar，或10.2和51.0 cmH2O）下流过该网络，而不影响生存力。文献报道，fMLF致敏的HC NDNs较多的滞留在MMM中，其中80％以上无法完全通过。相反，大于 80％的未致敏的HC NDNs在3s内通过MMM。SLE LDGs的运输模式与致敏的HC NDNs的运输模式相似，MMM中滞留了大于75％的SLE LDGs，以及大约50％的SLE NDNs（图5B）。穿过整个MMM，SLE NDNs和未致敏的HC NDNs的平均通过时间小于0.9 s，然而SLE LDGs和致敏的HCNDNs的平均通过时间分别为1.87s和2.89 s（图5C）。
用细胞松弛素D处理的HC NDNs会分解细丝肌动蛋白并降低中性粒细胞的可变形性，增加在MMM中的滞留（与对照的小于20％相比，细胞松弛素D处理的HC NDNs滞留率大于75％（图5D）），这支持生物力学调节改变中性粒细胞的运输。与致敏的HC NDNs相同，由于生物力学性质的差异，SLE LDGs可能优先滞留在微脉管系统中。
MMM评估了细胞生物力学特性对细胞运输的影响，但并未评估假定的中性粒细胞-内皮细胞相互作用，通过对中性粒细胞运输的生物物理特性和细胞表面标志物的解析，本文评估了中性粒细胞-内皮细胞的相互作用。使用二维测定法评估了模拟生理条件（流速0.4 mL/min）的循环血流系统中，中性粒细胞与微血管内皮并排或粘附的相互作用，在3min内，有15％致敏的HC NDNs与未刺激的内皮细胞相互作用，和60％致敏的HC NDNs与刺激的内皮细胞相互作用。与致敏的HC NDNs相比，未致敏的HC NDNs、SLE LDGs和NDNs，分别仅有<10％和<20％的细胞与未刺激和刺激的内皮细胞发生相互作用（图5E，F）。这些结果表明，中性粒细胞-内皮相互作用的增强可能有助于致敏的HC NDNs的微脉管滞留，但并没有解释SLE LDGs和NDNs微脉管运输差异的原因。总体而言，SLE LDGs滞留在微脉管系统中，可能是因为细胞生物力学性质的内在变化，而不是通过特定的中性粒细胞-内皮相互作用。
图5 系统性红斑狼疮（SLE）低密度粒细胞（LDG）在三维肺微脉管系统模拟物中滞留增加，但在二维流动系统中未显示出对内皮细胞的粘附性增强。
（A）设计了肺微脉管的分支微流模拟物，箭头指示入口、出口和网络中细胞的运行轨迹（10倍物镜）。（B）在微脉管系统模拟物中滞留的正常密度中性粒细胞（NDNs）和LDGs，HC（n=6）、SLE患者（n=6），每个亚群大于150个的中性粒细胞。释放的秒数是指每个中性粒细胞在模拟物中保留的时间，从入口进入到出口退出所测量的时间。如果细胞在2min的影像内没有离开模拟物，则释放的秒数记录为大于120s，在数据收集过程中，使用叠加在视频上的计时器手动确定时间，并使用对数秩检验进行统计学分析。（C）所有NDNs和LDGs在整个设备上通过微脉管模拟物的运输时间，并使用Mann-Whitney U检验评估显著性差异。（D）二甲亚砜或细胞松弛素D处理的HC NDNs（n=3，中性粒细胞数大于50个）在微脉管系统模拟物中的滞留。（E）在0.4mL/min流速下与内皮相互作用的中性粒细胞百分比。使用Kruskal-Wallis检验和事后Dunn检验进行多重比较分析。（F）流动实验后与内皮细胞结合的中性粒细胞光学显微镜观察。箭头表示致敏的NDNs结合增强，HC（n=6），SLE（n=6）。所有结果均以平均值±标准误表示，显著性设定为*p≤0.05，**p≤0.01，****p≤0.0001，ns =不显著。
讨论
本研究结果表明SLE与HC中性粒细胞的蛋白质组具有显著性差异，并明确了SLE中性粒细胞蛋白质组的异质性，包括参与细胞骨架形成/重排的蛋白质。此外，还确定了SLE LDGs的生物力学差异影响微脉管系统中中性粒细胞的转运。SLE LDGs中肌动蛋白细胞骨架相关差异基因表达的蛋白质组学数据与先前报道的转录组学数据是相符的，本文发现SLE LDGs在生物力学上与其他中性粒细胞亚群不同，并且与fMLF致敏的中性粒细胞的细胞膜扰动不同。目前，促进增强SLE LDG细胞骨架改变的机制尚不清楚，可能与胞外结构、组织和细胞溶解有关的蛋白质的丰度差异相关。例如，前纤维蛋白1（PFN1）调节肌动蛋白/微管动力学和肌动蛋白聚合，而富含组氨酸的糖蛋白（HRG）诱导中性粒细胞形态变化，这些都可能与中性粒细胞在微血管中的滞留相关。此外，SLELDGs形成NETs的能力增强可能会导致细胞骨架的扰动和细胞膜完整性的破坏，虽然LDGs NETs在形态上与Sm/RNP免疫复合物或佛波肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）处理HC中性粒细胞而诱发的NETosis的形态不相似，但已有报道显示自发LDG NET形成和PMA诱导的NET形成存在差异。NET的形成，中性粒细胞蛋白质组和LDGs的生物力学特性的潜在联系应进一步研究。
先前研究表明较粗糙的中性粒细胞会滞留在肺中，本研究MMM实验结果与之相似，LDG的粗糙度可能会阻碍LDGs通过狭窄的毛细血管和影响其生物物理特性，但不会增强与内皮的结合。中性粒细胞在微血管网络中滞留的增加可能对肺或肾损伤以及小血管病变的发展具有致病作用，SLE肺部临床表现与中性粒细胞触发的血管损害有关。循环免疫复合物可以激活中性粒细胞，促进内皮细胞屏障功能障碍和扰动血管通透性，虽然SLE LDGs独特的生物力学特性与微血管内皮细胞的优先结合并不吻合，但LDGs通过NET的形成对内皮具有潜在的有害作用。因此，本文提出了一个缓慢的LDG微脉管运输，结合增强的NETosis促进血管病变的模型，未来的研究应评估SLE LDG粗糙度增加的机制，以及其对体内LDG运输作用的意义。
与SLE LDGs相比，fMLF致敏的NDNs对内皮的粘附增强，并且与细胞粘附相关的磷酸化蛋白丰度较高。肌动蛋白调节蛋白在LDGs中被去磷酸化，而在致敏的中性粒细胞中被磷酸化，这表明肌动蛋白解聚和聚合都可能诱导影响细胞运输的生物物理特性改变。影像学检查显示，致敏的NDNs带有收缩的皮质肌动蛋白环，而LDGs的形状不规则、肌动蛋白环不完整。总体而言，SLE LDGs与急性致敏的中性粒细胞不同，并且与脉管系统的相互作用也不同。
I型IFN途径与SLE发病机理有关，对这些细胞因子有反应的中性粒细胞表现出促炎反应，SLE LDGs中ISG编码的蛋白较高，与已报道的转录组结果一致。在体内暴露于相同水平的细胞因子，为什么SLE LDGs会比自身的SLE NDNs表达更高的ISG编码蛋白，这可能与JAK-STAT活性的差异或激活状态的不同有关。相对于HC中性粒细胞，SLE LDGs增强的ISG低甲基化，可能调节了蛋白质反应。未来的研究应探讨增强的IFN反应如何调节LDGs形成NET和损害脉管系统的致病差异。
SLE LDGs蛋白质组与补体和凝血相关的急性期反应蛋白增加，证实了本文的结果，LDGs表现出几种补体成分的转录增强。相反，也有一些补体蛋白在蛋白质组中鉴定出，但未在转录组中鉴定出，例如C6-C9（可能与循环中的中性粒细胞结合），这与类风湿关节炎中性粒细胞中C6-C9参与MAC诱导的裂解孔形成的结果一致。此外，激活的HC NDNs中C3转录上调提示激活的LDGs也可能具有相似作用，LDG与补体的关系应进一步研究。
与牛皮癣LDGs相似，SLELDGs中与血小板生物学相关的某些蛋白质较为丰富，荧光显微镜观察证实了这一点，并提示了LDGs蛋白质组中与血管损伤增强相关的各种炎症性疾病的共性。血小板与中性粒细胞的相互作用可导致炎症和血栓形成，与NDNs比较，LDGs样品中血小板的增加可能有助于凝血以及与中性粒细胞活化相关的蛋白质上调。综上所述，LDGs与血小板相互作用可能在血管病变的发展中发挥独特的病理生理作用。
除蛋白质组学外，SLE LDGs的生物力学特征和运输模式也支持LDG代表独特的中性粒细胞亚群，而不是健康受试者中存在的未成熟/致敏的中性粒细胞的扩增。SLE LDGs具有独特的蛋白质组学特征和特定的生物力学特征，可影响通过微脉管系统的转运。本研究增加了在血管运输的背景下对中性粒细胞异质性的理解，对小血管血管病变和器官损伤的发展以及调节中性粒细胞生物力学特性的治疗的发展具有重要意义。