科研 | SCI TOTAL ENVIRON：转录组和代谢组联合分析意大利蜜蜂和中华蜜蜂抵御草甘膦胁迫的分子机制（国人佳作）
编译：寒江雪，编辑：景行、江舜尧。
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滥用农用化学品对蜜蜂造成生理和行为伤害，蜜蜂数量急剧下降的问题日益严重。目前草甘膦在农业领域和非农业领域广泛应用，但其对蜜蜂的作用模式在分子水平仍不清楚。本研究发现中华蜜蜂在草甘膦商业制剂(GCF)胁迫下的差异表达基因和代谢产物数量显著高于意大利蜜蜂。而且在中华蜜蜂和意大利蜜蜂中，随着GCF处理时间的延长，差异表达转录本的数量都表现为上升趋势。GCF对两种蜜蜂的免疫系统、消化系统、神经系统、氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及生长发育都有影响，同时影响了其中的关键基因和代谢产物的变化。在这两种蜜蜂中，GCF上调了许多与免疫、农化解毒和抗性有关的基因的表达，如抗菌肽、角质层蛋白和细胞色素P450家族等。本研究利用多组学手段研究两种蜜蜂通过调节排毒和免疫系统来减轻GCF造成的有害影响，发现相较于意大利蜜蜂，中华蜜蜂能以更容易适应来抵御草甘膦胁迫，本研究有助于阐明GCF对蜜蜂的生理和行为影响。
论文ID
原名：Transcriptomic and metabolomic landscape of the molecular effects of glyphosate commercial formulation on Apis mellifera ligustica and Apiscerana cerana
译名：转录组和代谢组联合分析意大利蜜蜂和中华蜜蜂抵御草甘膦胁迫的分子机制
期刊：Science of the Total Environment
IF：6.551
发表时间：2020年7月
通讯作者：胥保华、郭兴启
通讯作者单位：山东农业大学生命科学学院
DOI号：10.1016/j.scitotenv.2020.140819
实验设计
结果
在本实验中，与对照相比，GCF处理3天和5天对中华蜜蜂和意大利蜜蜂的存活率没有显著影响。为了确定GCF对蜜蜂的分子调控机制，研究人员对中华蜜蜂和意大利蜜蜂GCF暴露3天和5天后进行了转录组分析。鉴定到的基因个数以及基于FC＞1.5和p＜0.05筛选到的差异基因（DEG）情况统计如图1A所示。分析了GCF处理3天和5天的蜜蜂之间的差异，比较了两个组DEG发现有36个基因在两组中都上调，有17个基因在两组中都呈下调趋势，有23个基因表达变化相反（图1B）。GCF胁迫后，上调表达的基因主要参与抗菌肽、表皮蛋白、细胞色素P450基因家族。研究人员还发现，与GCF 胁迫3天的蜜蜂相比，两种蜜蜂5天的DEG数量都增加了，这表明随着处理时间的增加，GCF对蜜蜂的作用增强。
为了探究GCF处理下DEG的功能，对DEG进行了GO分析。两种蜂暴露于GCF 5天后，代谢过程、生长发育过程、对刺激的反应、繁殖和免疫系统相关的下调基因比例显著高于暴露于GCF 3天。表明GCF损害了如生长发育、繁殖和免疫系统过程等蜜蜂中的关键途径，并且这种有害影响随着GCF暴露时间的增加而累积。为了进一步确定DEG的功能，筛选了显著富集的前10个DEG的功能，发现GCF对蜜蜂体内的许多信号通路都有影响。
为了进一步探索暴露于GCF的蜜蜂体内DEG的功能，研究人员进行了KEGG富集分析。GCF暴露3天和5天下，中华蜜蜂的DEG与碳水化合物代谢、能量代谢、免疫系统和脂质代谢有关；意大利蜜蜂DEG与氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢等许多重要途径相关。这些结果进一步表明，GCF影响了蜜蜂体内许多重要的代谢途径。
图1.中华蜜蜂和意大利蜜蜂暴露于GCF后的转录组分析。A.不同差异分组下的差异基因数量统计；B.不同比较组的差异基因韦恩图分析；C.差异基因在不同通路上的上下调比例统计。
2 中华蜜蜂和意大利蜜蜂对GCF反应的转录组水平比较分析
为了比较中华蜜蜂和意大利蜜蜂对GCF的响应，对它们的转录组数据进行了比较分析。暴露于GCF3天和5天后，中华蜜蜂的DEG数量比意大利蜜蜂多，尤其是抗菌肽、表皮蛋白、OBP、气味受体、CYP450和热激蛋白家族相关的DEG。表明中华蜜蜂比意大利蜜蜂更敏感。
接下来通过韦恩图分析确定暴露于GCF后的中华蜜蜂和意大利蜜蜂中协同调控的DEG。在GCF暴露3天时，两种蜜蜂中有13个共有的DEG，包括都上调的基因8个，均下调的基因2个，还有3个表达模式相反的基因（图2A，B）。在GCF暴露5天时，两种蜜蜂中共有的DEG有52个，包括都上调的基因20个，都下调的基因27个和5个表达模式相反的基因。这52个基因的正相关关系（R=0.7712）强于GCF暴露3天时（R=0.3839）（图2C）。这些结果表明中华蜜蜂和意大利蜜蜂通过许多共同的基因抵抗GCF胁迫，且这一现象在暴露于GCF 5天时比3天更为明显。
GO分析显示，暴露于GCF胁迫下的中华蜜蜂和意大利蜜蜂共有的DEG在发育过程、免疫系统过程和对刺激的反应等许多关键通路中富集（图2D）。这些途径在两种蜜蜂对GCF的响应中都起到了一定的作用。此外，为了验证RNA-seq结果，研究人员进行了RT-qPCR检测，发现在GCF胁迫下中华蜜蜂和意大利蜜蜂中有很多基因被协同调控(图2E)，这与RNA-seq结果一致。
图2. GCF胁迫后两种蜜蜂的比较转录组分析。A.中华蜜蜂和意大利蜜蜂在GCF暴露3天(左图)和5天(右图)后的共有DEG的Venn图。B. DEG的表达量热图分析。C. DEG的相关性分析。D DEG的GO注释分析。E. RT-qPCR验证结果。
3 GCF对中华蜜蜂和意大利蜜蜂相对代谢产物丰度的影响
为了进一步研究GCF对蜜蜂的分子效应，研究人员进行了广泛靶向代谢组学分析。PCA和OPLS-DA分析显示出GCF处理后和相应的对照组蜜蜂之间有良好分离，表明组间有显著差异。中华蜜蜂在GCF处理5天与对照组相比，鉴定到595种代谢物，筛选出120种差异代谢物 (68个上调和52个下调)。意大利蜜蜂鉴定到596中代谢物，筛选出72种差异代谢物 (37个上调和35个显示下调)。
研究人员对差异代谢物进行了KEGG功能分析，从而探索GCF胁迫下的差异代谢产物的功能。两种蜜蜂的差异代谢物在氨基酸代谢、碳水化合物代谢、消化系统、能量代谢、免疫系统、脂质代谢、神经系统、感觉系统和膜转运等多种途径上富集（图3），说明GCF干扰了蜜蜂的正常新陈代谢。
为了在代谢水平上研究中华蜜蜂和意大利蜜蜂对GCF反应的异同，研究人员对它们的差异代谢物进行了比较分析。结果发现两组中有33个共有差异代谢物，其中包括15个均上调的代谢物和17个均下调的代谢物，还有一个反向调控的代谢物（图4A）。相关性分析表明，协同调控代谢物呈显著正相关(R = 0.918)(图4B)。这些协同调控的代谢物在如氨基酸和碳水化合物代谢等许多关键途径中富集(图4C)，这些结果表明，尽管存在一定的差异，但在GCF胁迫下两种蜜蜂均会采取防御策略。
图3. GCF胁迫改变了蜜蜂体内重要代谢途径中的代谢物丰度。A. 比较组中差异代谢物质的类别统计。B.差异代谢物丰度的热图分析。C.差异代谢物的富集气泡图分析。
图4. GCF胁迫下的共有差异表达代谢物分析。A. 共有差异代谢物韦恩图分析。B. 差异表达代谢物的相关性分析。C. 共有代谢物丰度热图分析。
4 GCF胁迫下蜜蜂转录本和代谢物的相关性分析
为了进一步了解蜜蜂对GCF胁迫反应的调控网络，对转录组和代谢组进行了相关分析。研究人员发现，在两种蜜蜂中许多基因和代谢产物表现出很强的正相关性（R>0.8）（图5）。这些结果表明，这些DEG可能在相应代谢物的改变中起直接或间接的调节作用。
研究人员还发现，中华蜜蜂和意大利蜜蜂许多DEG和差异表达代谢物富集在同一个KEGG通路，包括酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和刺激神经组织中的相互作用（图5B）。通过相关网络图进一步显示了中华蜜蜂与意大利蜜蜂的DEG与差异代谢物之间的联系（图5C）。这些结果进一步表明，GCF影响蜜蜂的转录和代谢调控网络。
图5.中华蜜蜂和意大利蜜蜂在GCF胁迫下转录和代谢数据的相关性分析。A. 暴露于GCF的中华蜜蜂(左图)和意大利蜜蜂(右图)中基因和代谢物之间的相关性的九象限图分析。B.差异基因和差异物质的KEGG共注释分析。C. 差异基因和代谢物的相关性网络图。
结论
本研究数据清楚的表明了GCF干扰了蜜蜂的转录和代谢调节网络。GCF对蜜蜂的不利影响随着GCF暴露时间的增加而增加。然而，蜜蜂协调关键的防御途径，如代谢过程、解毒、免疫系统和能量代谢，以促进它们在GCF胁迫下生存。中华蜜蜂对GCF的毒性有较好的耐受性。因此，中华蜜蜂能够以较低的适应成本耐受较高剂量的GCF。尽管存在一些差异，但在中华蜜蜂和意大利蜜蜂中，许多基因和代谢产物是共同调节以抵御GCF胁迫（图6）。这些结果将提高人们对GCF暴露的蜜蜂生理和行为伤害背后的分子机制的理解。
图6. 蜜蜂抵御草甘膦胁迫的分子机制。
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