科研│ PLANT BIOTECHNOL J（IF：8.154）：高时空分辨率转录组为柑橘的果实发育和成熟提供了见解（国人佳作）
编译：秦时明月，编辑：景行、江舜尧。
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柑橘果实具有独特的果实结构，不同果实组织的功能和形态各不相同。因此，在所有器官或混合组织水平进行分析不可避免地会掩盖许多组织特有的现象。组织特异性转录组避免了对空间位置特异性调控网络的丢失，并已被证明可以有效地揭示一些组织特异的生物学途径和调控网络。同时，结合涵盖柑橘果实从幼果期到成熟期的转录组测序无疑能为了解柑橘果实发育和成熟调控网络提供更为广泛和全面的信息。该研究通过对柑橘从幼果到成熟果实6个发育时期和4个主要组织类型（黄皮层、白皮层、囊衣和汁胞）为研究材料，基于高通量转录组测序、生理生化数据等对柑橘果实的发育和成熟调控机理进行了探讨。通过基于WGCNA和STEM分析鉴定出了几种组织特异性表达模块和一些在这个过程中可能起到重要调控作用的转录因子。柑橘属于非呼吸跃变型果实，但是对其成熟调控机理的了解尚浅。该研究对柑橘果实发育和成熟过程中的植物激素调控网络进行了系统的表达模式分析，同时结合ABA类似物外源处理等一系列验证试验，提出了一个ABF2介导ABA信号参与蔗糖运输、叶绿素降解、生长素体内稳态调控、类胡萝卜素和ABA生物合成以及细胞壁代谢的模型。此外，该研究还绘制了柑橘中蔗糖和柠檬酸代谢相关基因的详细时空表达模式，结合原位杂交、酵母单杂和双荧光素酶等实验鉴定了几个参与调控蔗糖和柠檬酸在汁胞中特异积累的关键基因。本研究在柑橘果实中揭示了不同组织之间特殊的调控模式，为了解柑橘果实在发育和成熟过程中的分子网络提供了重要的见解。
论文ID
原名：High-Spatiotemporal-Resolution Transcriptomes Provide Insights into Fruit Development and Ripening in Citrus sinensis
译名：高时空分辨率转录组为柑橘的果实发育和成熟提供了见解
期刊：Plant Biotechnology Journal
IF：8.154
发表时间：2021年1月
通讯作者：伊华林
通讯作者单位：华中农业大学
DOI号：10.1111/PBI.13549
实验设计
结果
1 柑橘果实组织特异性转录组的整体分析
为了揭示调控柑橘果实发育和成熟的潜在分子网络，研究人员使用RNA-Seq对24个果实组织样品的转录组进行了定量分析，包括6个发育时期(50–220 DAF)的4种组织类型(图1a)。果实在第二个生理落果期(50 DAF)、膨大期(80、120和155 DAF)、着色期(180 DAF)和成熟期(220 DAF)取样。图1b说明了24个组织之间的整体相对关系。除AL _ 2 _ 1和AL _ 3 _ 1外，每个样品的三个生物学重复都聚集在一起 (图1b)。对于AL、SM和JS组织，其他组织样本都聚集在一起：时期1和2；时期3和4；时期5和6(图1b)。在时期1和时期2，组织之间的差异小于时期之间的差异，而在时期3至时期6，组织之间的差异大于两个时期之间的差异(图1b)。
每个样本中保留了16621(JS6)至19455个(EP1)FPKM值大于0.3的基因，其中85%以上在1至100 FPKM范围内(图1c)。将来自同一组织的所有六个时期的基因结合起来，并使用韦恩图来揭示果实组织中独特或共同表达的基因(图1d)。共有18156个基因在所有四种果实组织中是共有的。值得注意的是，在四种组织中，EP具有最多的组织特异性基因。
为了识别柑橘果实发育过程中每个组织中不同的基因表达谱，研究人员使用STEM(短时间序列表达挖掘器)进行聚类。结果显示，分别在EP、AL、SM和JS中识别出11、13、11和7个具有统计显著性的模型轮廓 (图2a)。在这四种组织中，两种特殊的模型分布被鉴定(图2a)。韦恩图显示，在图谱39和图谱8中，四种果实组织中独特表达基因的数量多于共同表达基因的数量(图2b)，表明在果实发育过程中，每个果实组织中存在不同的调控网络。GO注释分析也揭示了类似的结果。此外，对这些基因进行了KEGG富集分析。如图2c所示，与柠檬酸循环、蛋白酶体、丙酮酸代谢和类胡萝卜素生物合成途径相关的基因更多地被上调而不是下调。值得注意的是，在JS所有柠檬酸循环途径基因中，富含TCA循环途径基因的比例达到51% (23/45)，表明随着柑橘果实的发育，TCA循环在JS中不断增强。
图1. 果实组织收集和果实转录组的整体分析。a 收集的六个时期和四种组织类型的柑橘果实，并进行RNA-Seq分析。b 显示生物重复之间以及不同时期和组织之间的整体关系的聚类图。c 每个组织中表达的基因数量，平均FPKM高于0.3。d 维恩图显示了四种果实组织中共有的和特异表达的基因数量。
图2. 各果实组织基因表达谱分析和功能富集分析。a 六个发育时期每个果实组织中基因的模块图谱。b 维恩图显示了在图谱8和39中的四种果实组织中共有的和特异表达的基因数量。c 四种果实组织中图谱8和39中聚集基因的KEGG富集结果。
2 共表达网络分析揭示了柑橘果实组织发育中不同的调控机制
为了揭示网络而不是单个基因的功能，使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)来构建共表达网络。分析产生了15个不同的模块，其中一个模块为灰色，表示没有交集的基因。对三个组织特异性模块(蓝色，2462个基因；紫色，313个基因；和黑色，442个基因)进行了进一步分析(图3a，d和g)。对蓝色、紫色和黑色模块的三个基因组进行GO注释分析(图3b、e和h)。在蓝色模块(EP特异性模块)中共表达的基因在“脂质代谢”、“对镉离子的反应”和“类黄酮代谢”生物过程中显著富集(图3b)。在紫色模块(AL和SM特异性模块)中，基因在“韧皮部或木质部组织发生”、“运输”和“对有毒物质的反应”生物过程中显著富集(图3e)。黑色模块(SM和JS特异性模块)的基因主要参与“翻译”、“核糖体生物发生”和“蛋白质转运”生物过程(图3h)。为了进一步确定这些模块中的关键调控基因，WGCNA和Cytoscape被用来构建和可视化基因网络，其中每个节点代表一个基因，基因之间的连接线代表共表达相关性。在网络中联系最多的中枢基因可能是关键的调节基因。在蓝色、紫色和黑色模块网络中，512个基因中的20个、152个基因中的18个和134个基因中的12个分别编码转录因子(TFs)(图3c、f和I；表S8)。例如，CsAPL是紫色模块网络中连接线数量最多(98条)的中心基因(图3f)。在其他模块网络中，高度连接的TFs包括CsKAN2 (Cs3g09270)、CsERF13 (Cs1g03290)、CsMYB5 (Cs9g03070)、CsTT8(Cs5g31400)等(图3c、f和i)。
在以前的研究中，ABA、JA和IAA在果实发育和成熟中起重要作用。研究人员检测了六个发育时期中每个果实组织中ABA、JA和IAA的含量(图5a、c和e)。通过WGCNA确定模块和植物激素之间的联系。如图4a所示，ABA与绿色模块高度相关，JA与黄色模块高度相关。没有一个模块与IAA高度相关。绿色模块中共表达的基因在“细胞大分子分解代谢”、“对渗透胁迫的反应”和“细胞内转运”中显著富集(图4b，c)。在黄色模块中，基因在“对伤害的反应”、“有机物代谢”和“对刺激的反应”中显著富集(图4d，e)。此外，还构建了绿色和黄色模块的基因网络，并突出了中心基因。此外，在棕色模块中，基因在六个发育时期的所有四个组织中持续下调或上调，主要涉及“对化学物质的反应”、“纤维素代谢”、“细胞死亡”和“细胞壁组织”生物过程(图4f，g)。值得注意的是，在棕色模块中鉴定了五个膨大蛋白基因，并且它们在膨大期间大部分被上调。例如，膨胀素-A1 (Cs5g10820)在EP中上调了180倍。此外，高表达扩展基因扩展-A8 (Cs7g29830)和扩展-A1 (Cs5g10820和Cs7g03630)的启动子区域含有ABA、GA和JA响应元件。
图3. 组织特异性基因的表达谱、功能和网络。a，d，g 特征基因的表达谱和热图，显示了蓝色、紫色和黑色模块中每个基因的FPKM。b，e，h 通过视图可视化的蓝色、紫色和黑色模块基因的GO注释分析结果。c，f，I 蓝、紫、黑模块的关联网络。
图4. 时期特异性基因的表达谱、功能和相关性。a 模块-植物激素关联分析。 b，d，f 特征基因表达谱和热图，显示了绿色、黄色和棕色模块中每个基因的FPKM。c，e，g 通过视图可视化的绿色、黄色和棕色模块基因的GO注释分析结果。
图5. 果实发育和成熟过程中四种果实组织中ABA (a)、IAA (c)和JA (e)水平的动态变化以及主要ABA (b)、IAA (d)和JA (f)相关基因在不同组织和时期的表达。
3 激素相关基因表达的时空分布
研究人员通过与拟南芥蛋白质序列进行比对，鉴定了参与植物激素(ABA、IAA、JA、GA、ETH、CK、BR和SA)的合成、分解代谢、运输、结合和信号传导的柑橘基因家族。对这些激素相关基因的log2 FPKM值进行分级聚类分析(图5b，d和f)。此外，还测定了6个发育时期果实组织中ABA、IAA和JA的含量(图5a、c和e)。
如图5a所示，四种果实组织中的脱落酸水平随着果实的发育而增加，并且这四种果实组织中脱落酸的含量不同。值得注意的是，脱落酸含量在膨胀期(120 - 155 DAF)增加了约3倍，在着色期和成熟期保持稳定。在120 DAF之后，脱落酸水平增加了3.95倍，达到45倍，在220 DAF达到高峰。测定了6个发育时期的4个果实组织中总类胡萝卜素的含量(图5f)，未观察到脱落酸含量与4个果实组织中总类胡萝卜素含量之间的关系。根据ABA水平，ABA生物合成基因NCED1/2/3/4、AAO3和AAO3以及ABA转运基因ABCG40和NRT1.2在发育的四个果实组织中表达逐渐上调(图5b)。然而，脱落酸分解代谢基因在四种果实组织中表现出不同的表达模式。例如，CYP70A1主要表达于胞外，在所有果实组织的早期发育时期都高表达(图5b)。因此，参与生物合成、运输、分解代谢和接合的基因共同调节每个果实组织中ABA的含量。此外，脱落酸信号转导模型'PYR/PYL/RCAR-PP2Cs-SnRK2s-ABFs’中几个基因的表达模式与脱落酸水平一致，包括PP2C8/51、SnRK2.1/2.4/2.8和ABF2(图5b)。这一发现表明，这些基因可能在柑橘果实发育过程中对脱落酸产生反应。重要的是，ABF2 (Cs3g23480)是ABA信号转导模型中的最后一个基因。
四种果实组织中IAA含量的趋势曲线呈倒V形(图5c)。SM和JS的IAA水平在120 DAF时达到峰值，而EP和AL的IAA水平在155 DAF时达到峰值(图5c)。生长素生物合成基因、流出和流入转运蛋白显示出显著的组织或时期特异性(图5d)。生长素生物合成基因YUCCA5和YUCCA10在EP中特异性高表达，而YUC3在JS中特异性高表达，这些基因随果实发育进程而上调表达。生长素外排转运蛋白主要表达在4种果实组织的EP、AL和SM中，或在50 DAF时表达，其中PILS1, PILS6, PILS7和PIN3在EP中高表达，PIN1, PIN3, PIN5 和PIN6在AL和SM中高表达。这种模式的一个例外是PILS2，它在成熟时期的SM和JS中高度表达(图5d)。生长素内流转运蛋白如LAX1、LAX2和LAX3主要表达在AL、SM和JS中(图5d)。综上所述，这些数据表明EP和JS可能是生长素的合成位点，然后生长素被运输到其他果实组织。
在IAA信号转导途径中，IAA受体基因AFB3和TIR1在所有果实组织中表达，但在EP和AL中的155–220 DAF处显示上调(图5d)。AUX/IAA、ARF和SAUR基因表现出明显的组织或时期特异性。例如，AUX2和IAA4主要在胚胎发育时期表达，而SAUR42在前三个发育时期的胚胎干细胞中特异表达(图5d)。GH3蛋白催化IAA与氨基酸的结合，从而减少游离IAA，并形成负反馈环来控制IAA的同质性。在本研究中，鉴定了六个GH3基因，即DFL1、DFL2、两个GH3.1基因、GH3.6和GH3.9。在这六个GH3基因中，只有GH3.1 (Cs1g22140)在155 DAF后在所有四种果实组织中显著上调(从5.3倍至177倍)，在此时期，所有四种果实组织中IAA含量下降1.46倍至3.75倍(图5c，d)。因此，研究人员假设GH3.1可能在IAA同质化中起重要作用。
如图5e所示，研究人员的数据表明，除了在50 DAF外，JA主要存在于EP和AL组织中，而在80–155 DAF的SM和JS组织中JA的含量远低于EP和AL组织。在EP和AL，JA水平在80或120 DAF时略有上升，在155 DAF时达到峰值，在180 DAF时逐渐下降，在220 DAF时几乎为零。这一结果与JA合成和信号基因的表达模式一致。如图5f所示，在50 DAF时，JA合成和信号基因在所有时期的果实组织中都有高表达。综上所述，这些结果表明JA主要在柑橘果实发育和成熟过程中起着重要作用。
与其他五种植物激素相关的基因表达谱也显示出显著的组织特异性或时期特异性特征。大多数与ETH相关的基因，如ETH生物合成基因(ACS1、ACS6、ACS9、ACO1和ACO4)和信号基因(ERF1和ERF2)，在果实发育早期(50–80 DAF)高度表达；此外，一些基因在EP和AL中高度表达，包括ACO2、ACO4、EIN3和EBF1/2。在120或155 DAF后，大多数与GA相关的基因逐渐减少，而GID1s和PIF3基因的表达在155或180 DAF显著增加。随着果实发育，水杨酸相关基因在所有果实组织中的表达逐渐增加。细胞分裂素和油菜素类固醇基因没有明确的模式，表明这两种植物激素在柑橘果实发育过程中具有复杂的调控网络。
4 柑橘果实可溶性糖和有机酸积累关键基因的挖掘
柑橘类果实的味道由可溶性糖和有机酸的含量决定。在成熟的柑橘类果实中，蔗糖、果糖和葡萄糖是主要的可溶性糖，柠檬酸和苹果酸是主要的有机酸。在这项研究中，果肉中的可溶性糖在80 DAF时迅速积累，在155 DAF时适度积累(图6a)。对于有机酸，果肉中柠檬酸的含量在发育早期显著增加，在80 DAF达到峰值，在80–220 DAF逐渐减少，而苹果酸的含量在80 DAF达到峰值，在120 DAF下降，在155 DAF适度增加。奎尼酸的含量不断减少，在220 DAF时几乎为零(图7a)。
柑橘类果实主要直接积累蔗糖。因此，蔗糖从源到库的转运调节对柑橘果实蔗糖积累至关重要。在这项研究中，研究人员鉴定了13个蔗糖转运体，3个SUT转运体和2个三甲基蔗糖转运体。如图6b所示，这些蔗糖转运蛋白在柑橘果实的六个发育时期均有不同的时空表达模式。例如，SUT4、TMT1、TMT2和SWEET16在所有四种果实组织中都表达，并且它们的表达水平随着果实的发育而增加。有趣的是，研究人员注意到SWEET15在SM和JS中特异性高表达，而SWEET10在SM中特异性高表达。此外，随着果实的发育，SWEET10和SWEET15的表达水平逐渐上调(图6b)。系统发育分析表明，SWEET10、SWEET12和SWEET15聚集在一起，这表明这些基因具有相似的功能。此外，SWEET15的表达水平与'Anliu’橙及其芽变 'Honganliu’橙果实糖含量呈正相关(R2 = 0.8763)(图6c)。这种关系和组织特异性表达模式在不同的柑橘品种中得到进一步验证，包括甜橙(R2 = 0.7758)、松皮柑橘(R2 = 0.8254)和柚子/葡萄柚(R2= 0.7293)。此外，荧光原位杂交表征了在JS中SWEET15的表达模式。如图6d所示，SWEET15在表皮细胞中表达。此外，还鉴定了参与蔗糖生物合成和分解代谢的基因，除CWINV5和SBPase外，大多数基因在四种果实组织中的表达模式相似。大多数蔗糖生物合成基因，如SPS1/2、SPP1和CCR4A，在四种果实组织的成熟时期被上调，而大多数蔗糖合酶基因，如SUS1/3，将蔗糖水解为果糖和UDP-葡萄糖，随着果实的发育而逐渐被下调。然而，几个转化酶基因(将蔗糖水解为葡萄糖和果糖)表现出不同的表达模式。液泡转化酶基因bFrut1和细胞壁转化酶基因INV4随着果实发育在四种果实组织中逐渐上调，而细胞壁转化酶基因INV3则相反。
柠檬酸是柑橘类果实中的主要有机酸。因此，研究人员在四个果实组织中鉴定了参与柠檬酸生物合成、分解代谢和转运的基因。以前的研究表明，有机酸从液泡和线粒体的流入和流出对柑橘果实中有机酸的积累很重要。因此，研究人员专门挖掘了与柠檬酸盐和苹果酸盐转运相关的基因(图7b)。如图7b所示，大多数H+ ATPase基因随着果实发育在所有果实组织中逐渐上调。特别是CsPH8 (AHA10)在SM和JS中特异表达，在JS中高表达。然后，研究人员分析了CsPH8在四个不同柑橘品种('Succari’，'Bingtang’, 'Xinhui’ and 'Newhall’)中的表达；这些品种的柠檬酸含量差异很大。研究人员观察到CsPH8的表达与柠檬酸的含量高度相关(图7c)。此外，MYB5 (Cs9g03070)、TT8 (Cs5g31400)和CPC (Cs2g21750)三种转录因子与CsPH8高度共表达。介导柠檬酸从液泡流出的CsCit1，以及介导苹果酸流入液泡的ALMT4和ALMT9在所有果实组织中均被上调。这些发现与柠檬酸和苹果酸的含量一致。此外，参与柠檬酸生物合成和分解代谢的基因也调节柠檬酸的积累。大多数参与柠檬酸生物合成和分解代谢的基因在四种果实组织中表现出相同的表达模式，并且它们的表达随着果实的发育而不断上调。为了进一步确定参与柠檬酸和苹果酸代谢调节的关键基因，研究人员构建了JS组织的基因表达调节网络图(图7d)。
图7. 柑橘果实有机酸积累相关基因在不同组织和时期的表达。a 各时期汁浆中有机酸的含量。b 柠檬酸和苹果酸转运相关基因在不同组织和时期的表达。c 四个不同的柑橘品种中CsPH8的表达模式。d 柑橘果实发育和成熟过程中汁囊细胞中柠檬酸和苹果酸代谢相关基因的时间表达模式。
5 外源ABA类似物促进柑橘果实成熟
转录组分析结果表明，在柑橘果实发育的不同时期，ABA在不同的生物过程中起着重要的作用。因此，研究人员试验了外源ABA类似物AM1对柑橘果实发育的影响。AM1显著促进柑橘果实着色、叶绿素降解和糖分积累(图8a-d)，降低果皮和果肉中IAA的含量(图8e)；AM1介导的蔗糖积累促进作用尤其显著。此外，研究人员用qRT-PCR来量化不同途径中的基因，包括IAA结合(图8f)、细胞壁代谢(图8g)、类胡萝卜素生物合成、ABA信号(图8h)、叶绿素降解(图8i)和糖转运途径(图8j)。值得注意的是，几个基因的表达，如ABF2、RRCR、SWEET15和GH3.1，在很大程度上被AM1上调(图8)。这些结果表明ABA对柑橘果实的发育和成熟至关重要。
6 ABF2在柑橘果实成熟过程的ABA信号转导中起主要作用
根据上述结果，ABF2是介导ABA信号传导的关键基因。研究人员鉴定了几个与ABF2共表达的基因，它们在启动子中包含至少一个ABA应答顺式元件(CACGTG或ACGTG)(图9a)。这些基因包括类胡萝卜素和ABA生物合成基因(PSY、Z-ISO、NCED1/2/4)、叶绿素分解代谢基因(HCAR、PAO、RCCR、PPH和NY1)、糖转运基因(SUT4、SWEET10/15/16)、IAA结合基因(GH3.1)和果实膨大和软化相关基因(Expansin-A1/A8)。ABF2和其中几个基因之间的相互作用通过酵母单杂交(Y1H)分析或双荧光素酶分析得到了进一步验证(图9b，c)。根据转录组数据和验证分析，研究人员提出了一个模型来说明柑橘果实中由ABF2介导的ABA信号调节网络(图10a)。在该模型中，ABF2起主导作用，参与蔗糖转运、叶绿素降解、IAA稳态、类胡萝卜素和ABA生物合成以及果实膨大和软化的调节。
图10. ABA信号和蔗糖积累模型。a 柑橘果实发育和成熟过程中由ABF2介导的ABA信号调控网络。b 蔗糖转运蛋白启动的蔗糖多步转运模型。
结论
本研究通过分析高时空分辨率转录组的数据为柑橘果实发育和成熟提供了重要的见解，揭示了柑橘果实发育和成熟过程中ABA的信号调控网络、发现了ABA信号和IAA信号之间的相互作用以及鉴定了一些参与蔗糖积累和柠檬酸代谢的关键基因，为柑橘熟期育种及果实品质改良提供了重要的理论依据和基因资源。
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