编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
转录错误率由于DNA损伤的存在导致转录过程中错误插入而显著增加。这一过程称为转录诱变（TM），能够导致蛋白功能的改变。在这里研究者在人类肺H1299细胞中测定了O6-甲基鸟嘌呤(O6-meG)对p53转录及后续反式激活的作用。TM的水平以及反式激活的作用通过RNA-seq全基因组测序确定。结果显示47%的p53转录本在转染后6h对应损伤的位置有一个尿嘧啶核苷的错配，在24h下降到18%。与野生型相比，在这些水平的TM使p53 DNA结合活性分别降低至21%和80%。对基因表达数据分析确定了由于p53 TM导致的差异表达基因。研究者发现> 100个高度可信的p53靶基因的反式激活表现出瞬时的抑制作用，例如细胞周期、DNA损伤应答和凋亡的调节因子。此外，TM能够抑制p53对一些增殖和分化负调控因子的转录下调。研究者的工作证实即使限制TM对单一转录因子的效应，仍然具有改变基因表达程序以及多样化细胞表型的潜能。
原名：Transcriptional mutagenesis dramatically alters genome‑wide p53 transactivation landscape
译名：转录突变显著改变全基因组p53的转录激活情况
期刊：Scientific Reports
影响因子：3.998
发表时间：2020年8月11日
作者：Kristian Dreij
单位：卡罗琳学院环境医学研究所
DOI：10.1038/s41598-020-70412-4.
我们环境中存在的过多药物导致多样的DNA损伤，对细胞基因组的稳定性构成了持续的威胁，而与细胞的增殖状态无关。突变的潜能以及DNA复制过程中DNA损伤的后果已经被充分研究，并且与基因组的不稳定性以及一系列疾病相关，包括癌症。然而，大多数哺乳动物细胞存在于自然组织和内稳态非增殖的或者生长缓慢的状态，并且它们的存活很大程度上依赖转录。转录延伸机制遇到DNA损伤可能会影响RNA合成，不仅能导致转录停滞，反之活化转录耦联的修复，而且允许绕过潜在的错配事件进入新生成的RNA，通过TM导致突变体转录本的生成。有报道称在哺乳动物体外和体内系统中由于DNA碱基的烷基化、氧化和脱胺作用导致的频繁发生的小损伤能够诱导TM事件，导致突变转录本的产生以及蛋白功能的改变。在疾病发展过程中这些细胞表型的瞬时改变仍然不清楚。然而，越来越多的证据表明TM可能通过转录抑制因子的失活或者粗癌基因的激活促进肿瘤的发生发展。转录抑制基因的失活能够负调控细胞增殖，是肿瘤发生发展主要标志之一。TP53是人类最重要的经典转录抑制基因之一。P53蛋白主要作为转录因子发挥作用，并且主要通过大量靶基因的转录激活激发它们在肿瘤中的转录抑制作用，反之调节多个重要的细胞过程，包括细胞周期、凋亡、DNA损伤、代谢、自噬、翻译以及反馈机制的调节。这是由不同时间依赖的靶基因反式激活调控的，同时在p53活化的早期细胞周期基因产生，而大多数凋亡基因产生是相对更晚的事件。尽管p53是一个转录激活因子，它也能通过CDKN1A/p21调节细胞周期基因等的下调。不足为奇的是，在超过半数人类癌症中p53突变导致功能丧失，与其他转录抑制因子不同，大部分TP53突变体是发生在蛋白DNA结合结构域中的无义突变，导致一个显性-阴性的表型以及反式激活靶基因的能力减少，例如热点突变体R248W。此外，p53已经被证明具有功能获得的突变体，具有新的促癌功能，尽管尚未完全确定。研究者近期发现在密码子248位O6-meG诱导的TM，能够通过细胞周期的异常调节降低p53肿瘤抑制因子的功能，并且损害人类细胞中凋亡的活化。部分是通过一些p53主要的靶基因反式激活介导的，包括CDKN1A和BBC3。TM在全基因组对p53作为转录因子功能的影响尚不清楚。在本研究中，研究者对人类细胞进行RNA-seq，在全基因组的水平评估了在密码子248位时间依赖TM对p53靶基因转录调节的影响。O6‑meG诱导p53产生TM降低了p53的DNA结合能力通过RNA-seq对密码子248为对应位置p53转录本TM内容进行了确定。为了确定p53 TM的时间依赖性，研究者在转染后早期(6 h)和晚期(24 h)的时间点进行了测定。正如所期盼的，表达野生型或者RW突变体p53蛋白的细胞在该位置的转录本分别有< 1%和>99%尿嘧啶核苷掺入（表1）。具有AGT活性细胞在O6-meG后的转录将会导致低水平的尿苷掺入，在两个时间点分别为0.24%和0.39%。通过O6-bzG使AGT失活增加了尿苷掺入。研究者并未检测到其他错配。之前报道称O6-bzG预处理没有细胞毒性并且抑制AGT的活性>95%可以高达24h。在早期时间点中TM的水平进一步通过基于PCR的方法证实，结果显示在AGT失活细胞中损伤的对应位置有51.0 ± 3.0% (mean ± SE, n = 4)尿苷掺入。TM对p53蛋白功能的影响通过基于ELISA的DNA结合活性实验进行评估。结果显示 TM水平和蛋白活性具有一个明显的负相关。在早期时间点，TM能够显著降低p53的 DNA结合至野生型的21%(P < 0.001)（图1A）。与晚期时间点TM的低频一致的是，活性仅降低至野生型p53的80%（图1B）。与预期的一样，RW突变体p53在两个时间点的活性都显著降低。不同载体来源的p53表达水平相似（图1C），由此由于p53表达水平的差异限制了对DNA结合活性的影响。与之前的报道比较发现p53的异源表达与人类细胞中应答DNA损伤的活化p53的表达水平相当。
图1 TM对p53 DNA结合活性的影响
RNA-seq确定了p53状态依赖的基因表达的改变在材料和方法中描述了差异表达的基因。FDR ≥2以及校正过的P < 0.05定义为基因表达的显著改变。在转染后6h野生型p53中差异表达基因（DEGs）有652个（其中643个上调9个下调），RW突变体p53中有1个，p53 O6-meG中有438个（407个上调31个下调），p53 TM有15个（14个上调1个下调）。在转染后24小时野生型p53中差异基因有2101个（1718个上调383个下调），RW突变体p53中有1个，p53 O6-meG中有1708个（1354个上调354个下调），p53TM中606个（其中577个上调29个下调）。这说明在应答所有载体中DEGs的数目随着时间升高，除了RW突变体p53并没有导致任何DEGs。在两个时间点无论是否存在TM，表达O6-meG修饰的p53与野生型p53的细胞内表达显著改变的基因重合高（图2）。然而，这并未排除不同的信号通路或者功能分类受TM的影响。
图2 RNA-seq对p53状态依赖差异表达基因的分析
利用CIBERSORTx对两个时间点DEGs进一步分析发现p53 TM能够影响细胞群体的表型（图3）。在早期时间点，47%突变的p53转录本所对应的细胞群体中65%的细胞表现出“突变体p53”基因表达程序。在晚期时间点，TM的水平更低在18%，所对应的细胞群体中48%的表现出突变p53的表型。这些数目与DNA结合活性一致。在活化DNA修复存在下，依据O6-meG 诱导TM的背景水平，在两个时间点中大约与90%野生型p53对应。为了进一步研究p53 TM的细胞内效应，研究者进行了更详细的GO和信号通路分析。
图3 野生型和突变体p53差异表达基因的数量分析
TM降低p53靶基因的反式激活影响了一些经典的信号通路研究者之前发现p53在密码子248位TM抑制了一些靶基因的反式激活。为了在全基因组水平进行研究，在上述早期和晚期时间点研究者评估了343个高度可信的p53靶基因(HCGs)的反式激活水平。与蛋白表达水平一致，不同载体TP53的基因表达水平在所有条件下相似(6.6 ± 0.1 log2-fold, mean ± SE, n = 8)，从而将基因表达水平的任何影响局限在由于TP53表达水平。RNA-seq结果提示野生型p53的表达导致H1299细胞中6h和24h分别有125和192个HCGs表达（图4A），在这两个时间点中有120个基因重合。p53的TM能够分别降低6h和24h 122和123个基因的表达水平。与TM低水平一致，活化AGT的存在并不能抑制两个时间上任何基因的反式激活。为了确定TM对p53依赖反式激活的任何时间依赖的效应，研究者确定了三个集簇；反式激活的早期抑制（52个基因在6h降低）、持续抑制（70个基因在两个时间点都降低）以及晚期抑制（53个基因在24h降低）是由于TM（图4B）。早期被抑制的基因包括FAS, SESN1, TP53I3, 以及XPC；持续抑制包括ADGRG1, CDKN1A, PLK2, 以及PRDM1；晚期抑制有ATF3, BMP7, CAV1和VDR（图4C）。显著的是，属于后者集簇的大多数基因并不包括6h野生型p53的表达。P53 TM对反式激活的效应通过一些早期和持续抑制基因的实时定量PCR证实（图5A-B）。比较三个小组中p53 TM对HCGs反式激活的效应与应答元件的反式激活潜能，并未发现清楚的关联，提示观察到的瞬时集簇并不与应答元件的功能相关。为了进一步说明在细胞基础过程中这种短暂变化的作用，对三个集簇间生物学过程进行GO富集分析。尽管三个集簇都包含特异的基因，在早期和持续被抑制的基因反式激活间发现了生物学过程的显著重合（图4D）。这些过程包括与DNA损伤应答以及细胞周期调节相关的GO条目。正如预期的那样，在三个集簇中被注释为参与p53信号通路的基因，与GO条目中与凋亡信号通路相关。反式激活晚期抑制相关的基因与另两个集簇富集的生物学过程GO条目不同，并且包括腺体形态发生、肽酶活性的调节和参与发育的凋亡过程。这些结果表明，p53的TM以时间依赖的方式可以解除对细胞内稳态发挥重要的作用的几种典型通路的调控。
图4 p53 TM对高度可信靶基因反式激活的时间依赖的影响
综上所述，H1299细胞处理6h和24h分别有9个和383个基因应答野生型p53后下调。对后一个小组进行GO条目富集分析发现这些基因中许多与细胞周期调节相关，证实在H1299细胞中细胞周期基因依赖p53的下调。在晚期时间点P53的TM抑制171个基因的下调，包括CCSAP, CDK1, GFI1,以及STOX1（图6A），但是GO条目富集中并未发现。这些基因的下调受到抑制通过实时荧光定量PCR证实（图5C）。在早期时间点，对应的有3个基因，两个ncRNAs和一个小的GTPase蛋白RASL11B。利用IPA对171个异常调节的基因进行信号通路分析。分析结果说明E2F转录因子家族是这些基因中最最重要的上游调节因子，包括细胞周期基因CCNE2, CDK1以及E2F8。基于171个异常调节基因利用IPA确定这些基因同样是高分值调控网络中的一部分（图6B）。调控网络中包含的基因参与生物学过程包含细胞分化（CA2, HOOK1以及NKX6-1）、细胞分裂（ERCC6L, FBXO5 以及LEF1）、刺激应答（ABAT,SERPINB9以及SESN3）以及内稳态过程（ABAT, CA2以及SLC4A3）。调控网络也包括MAPK, Akt, 以及Wnt蛋白家族的成员作为上游调节因子或者下游效应因子，在调节分化和增殖相关信号通路中发挥重要作用TM间接影响p53的转录下调说明TM在内稳态维持异常调节细胞机制中的重要作用。
图5 实时荧光定量PCR证实TM对p53靶基因反式激活时间依赖的影响
图6 TM抑制p53的转录下调
研究者在人类肺H1299细胞中测定了O6-甲基鸟嘌呤(O6-meG)对p53转录及后续反式激活的作用。TM的水平以及反式激活的作用通过RNA-seq全基因组测序确定。结果显示47%的p53转录本在转染后6h对应损伤的位置有一个尿嘧啶核苷的错配，在24h下降到18%。与野生型相比，在这些水平的TM使p53 DNA结合活性分别降低至21%和80%。对基因表达数据分析确定了由于p53 TM导致的差异表达基因。研究者发现> 100个高度可信的p53靶基因的反式激活表现出瞬时的抑制作用，例如细胞周期、DNA损伤应答和凋亡的调节因子。此外，TM能够抑制p53对一些增殖和分化负调控因子的转录下调。研究者的工作证实即使限制TM对单一转录因子的效应，仍然具有改变基因表达程序以及多样化细胞表型的潜能。
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