科研 | CELL STEM CELL:新生儿HSC个体发育的单细胞测序揭示了出生前开始的渐进和不协调的转录重编程
编译：Champion，编辑：景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
胎儿和成人造血干细胞（HSCs）具有不同的增殖率、谱系偏向、基因表达谱和基因依赖性。虽然这些差异得到了广泛的认可，但尚不清楚从胎儿身份到成人身份的转变是如何协调的。本研究通过对胚胎（E）16.5天、出生后（P）7天、P14天和出生后8周收集的造血干细胞和造血干细胞进行了scRNA-seq和ATAC-seq测序，表明小鼠造血干细胞和承诺的造血祖细胞（HPC）经历了一个渐进的，从胎儿到成人转录状态的转变。这一转变在出生前就开始了，并被I型干扰素信号的晚期产前峰值所打断，I型干扰素信号促进了围产期HPC的扩张，并使祖细胞对导致白血病的FLT3ITD突变敏感。基因表达和增强子激活的大多数其他变化的时间不精确，协调不佳。因此，异时增强子元件及其相关的转录本相互独立地被激活，而不是作为强健网络的一部分。这简化了指导新生儿HSC/HPC个体发育的调控程序，但它在这些人群中造成了异质性。
论文ID
原名：Single-Cell Analysis of Neonatal HSC Ontogeny Reveals Gradual and Uncoordinated Transcriptional Reprogramming that Begins before Birth
译名：新生儿HSC个体发育的单细胞测序揭示了出生前开始的渐进和不协调的转录重编程
期刊：Cell Stem Cell
IF：20.86
发表时间：2020年8月
通讯作者：Samantha A. Morris & Jeffrey A. Magee
通讯作者单位：华盛顿大学医学院
DOI号：10.1016/j.stem.2020.08.001
实验设计
结果
为了测试从胎儿身份到成人身份的转变是渐进的还是双模式的，研究者对人胚胎日（E）16.5天、出生后（P）7天、P14天和出生后8周收集的造血干细胞和造血干细胞进行了scRNA-seq（图1A）。研究者预计，如果过渡是双模的，P7和P14的祖细胞将与胎儿或成年祖细胞聚集在一起，如果过渡是渐进的，它们将单独聚集（图1B）。使用Seurat对细胞进行聚类，并使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE）进行可视化（图1C和1D）。胚胎、出生后和成人的造血干细胞结合成三个独立的簇（图1C和1D），这些模式与分级过渡最为一致。为了更好地量化P7和P14祖细胞与胎儿或成年祖细胞相似的程度，使用二次编程为每个细胞分配成人身份分数。I型干扰素靶标的成人身份基因显著富集。在以前的研究中或在本研究的移植试验中，许多胎儿识别基因促进了自我更新。当使用精选的列表来计算每个细胞的成人身份分数时，研究者发现在每个年龄段，造血干细胞和造血干细胞比之前年龄段的细胞更像成人，而不像胎儿（图1E-1H）。接下来，测试了非监督分析是否会类似地揭示HSC/HPC身份的渐进性、线性变化。使用完整的表达基因列表。接下来，根据每个细胞的同一性分数计算每个基因的预测表达值，并测量实际基因表达与预测值的差异程度。研究者确定了两组主要的基因，一组随着时间的推移高度可变，并驱动成人身份评分的变化，另一组相对静态。从每组中随机选择214个基因（HSC）或115个基因（HPC），以匹配非随机选择的基因集的大小。然后，计算成人认同感得分，并重复这个过程100次，平均得分。观察到随着时间的推移逐渐向成人的造血干细胞转变，特别是当高度可变的基因时。使用迭代聚类和引导基因选择来执行对胎儿、新生儿和成人造血干细胞基因表达的非监督分析。ICGS应该捕获瞬时表达的基因簇，但造血干细胞没有根据年龄进行聚类。相反，聚类是由与DNA复制和细胞分裂相关的基因的表达（图1J，簇1、2和4）和I型干扰素目标基因的表达（簇3）来指导的。这种集群模式反对从胎儿身份到成人身份的离散转变。它确实暗示I型干扰素信号是一个潜在的时间调节因子。基因表达的变化与HSC增殖的逐渐下降相一致（图1K）。总之，数据显示造血干细胞经历了一个渐进的、持续的从胎儿到成人转录状态的转换，而不是突然的双模式转换。这提出了一个问题，即如何协调和把握这样的过渡时间。
图1. 从胎儿到成人HSC/HPC身份的转变是渐进的。（A）scRNA-seq实验概述。（B）scRNA-seq可以解决从同步、分级过渡到异步、双模过渡。（C和D）出生后的HSCs/HPC分别来自胎儿和成人的HSCs/HPC。（E-H）HSCs（E和F）和HPCs（G和H）的成人认同感得分。（I）根据从表现出低或高变异性的群体中随机选择的基因，对成人身份进行评分。（J）对HSC单链RNA-序列时间进程的ICGS分析。热图显示了四个细胞簇，右侧显示了对引导基因的反应组路分析。（K）在指定年龄的HSC中24小时掺入BrdU。
2 HSC/HPC基因表达的时间变化是不精确的，并且在单细胞水平上协调度不良
同一时间的变化可以通过几种不同的机制产生。一种可能性是，精密的调控网络允许细胞自身标记时间，并在基因表达中执行协调的、特定阶段的变化（图2A）。第二种可能性是，外在因素再次以协调的方式引导基因表达的时间变化。第三种可能性是造血干细胞和造血干细胞以不协调的方式激活成人身份基因，并使胎儿身份基因失活（图2B）。在这个模型中，发育速度是由个体基因从胎儿状态转换到成人状态的随机可能性决定的，而不是由顺序的时间因素决定的。这个路线更简单，因为它不需要组成基因之间精确定时的相互作用，但它噪音很大。为了区分这些潜在的模型，研究者评估了个体胎儿和成人身份基因的表达作为成人身份分数的函数，之后发现，在单个细胞中，基因表达的变化并不存在精确的时间段。胎儿基因，如Igf2bp2、HMGA2和Arid3a，不仅在胎儿HSCs/HPC中表达，而且在成人认同感得分较高的细胞亚群中也表达（图2C）。同样，成体基因，如Cpne2、H2-Q7和Sds1，不仅在成体HSCs/HPC中表达，而且在成体同一性得分较低的细胞子集中也表达（图2D）。在每个测试年龄，单个造血干细胞表达不同的胎儿和成人身份基因组合，但成人和胎儿转录本的比例相似（图2E和2F）。这些模式与一个模型一致，在这个模型中，大多数胎儿身份基因被关闭，大多数成人身份基因被打开，彼此独立，而不是作为紧密协调、精确计时的发育计划的一部分。为了进一步评估异时基因被协调调控的程度，研究者采用了加权基因共表达网络分析（WGCNA）来处理scRNA-seq数据。WGCNA可以识别基因共表达的模块化模式，当细胞经历高度协调的状态变化时，这种模式最为明显。例如，WGCNA成功识别了在HSC向HPC分化过程中共表达的基因模块（图2G和2H）。然而，与分化范式相反，WGCNA未能在出生后HSC/HPC发育期间确定胎儿或成人身份基因之间的强烈相关性（图2I和2J）。这表明，在单细胞水平上，HSC/HPC基因表达的渐进性、时间性变化比伴随分化而来的变化协调得不那么紧密。
图2. 胎儿身份基因被灭活，成人基因被激活。（A）从胎儿身份到成人身份协调过渡的示意图概述。随着细胞变老，单个基因或增强子（如箭头所示）会从胎儿状态转变为成人状态。（B）不协调过渡的示意性概览。（C和D）Igf2bp2和Cpne2的表达是成人认同感得分的函数。（E和F）表达Igf2bp2的HSCs/HPC比例随年龄增长而下降，表达Cpne2的HSCs/HPC比例随年龄增长而增加。（G和H）在HSC向HPC分化过程中差异表达的基因的WGCNA，相关系数表明共表达的模块模式。（I和J）胎儿和成人的身份基因表现出不共同表达的模式。
3 新生儿表观基因组重编程是渐进的和不协调的
接下来，研究者测试了HSC和HPC表观基因组在新生儿发育过程中是否也经历了渐进的、不协调的变化。研究者使用ATAC-seq和ChIPaging来确定染色质区域和增强子元件，它们在HSC/HPC发育的胎儿和成人阶段之间获得或失去可及性。研究者评估了P7、P14和P21的ATAC-SEQ峰值高度。观察到从胎儿到成人的染色质可及性模式的逐渐转变，甚至在P7时也很明显（图3A和3B）。鉴定了1230个假定的增强子-ATAC-seq峰与重叠的组蛋白3，赖氨酸4单甲基化（H3K4me1）峰-定位在100kB的成人身份基因范围内。其中，271个增强子在成人造血干细胞/造血干细胞中的活性基于组蛋白3，赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）（图3C-3E），并且它们逐渐从胎儿ATAC-SEQ图谱转化为成人ATAC-SEQ谱（图3F）。成体增强剂富含ETS、RUNX、AP-1和IRF结合基序（图3G）。只有20%的人符合超级增强剂的标准（图3H）。对先前描述的CHIP-SEQ数据的分析表明，增强剂与表征良好的造血转录因子（图3i）结合，这些因子在大多数情况下在每个年龄以相似的水平表达。对这种模式的一种解释是，成体增强剂可能含有大量造血转录因子的低亲和力结合位点。转录因子之间罕见的、低亲和力的相互作用可以逐渐地、非均匀地激活单个增强子。为了测试成人增强剂是统一使用还是非统一使用，研究者评估了E16.5、P7和P14的HSCs/HPC中单个ATAC-seq峰相对于成人的高度。观察到的峰高变化是递增的，而不是双峰（图3K和3L）。这一观察结果与非均匀的、持续的表观基因组重塑最为一致。总之，表观遗传学分析加强了研究者的scRNA-seq观察。在这种模型中，成人身份基因及其相关的增强子相互独立地激活，而不是作为精确计时路线的一部分。
图3. 新生儿HSC/HPC表观基因组重构是渐进的和不协调的。（A和B）对指定年龄的HSC和HPC进行ATAC-seq分析。（C）ATAC-seq（红色）、H3K4me1（绿色）和H3K27ac（紫色）的增强子峰位于成体身份基因的100kB以内。（D）有代表性的追踪成人身份基因Cpne2。（E）成人促进剂的H3K4me1和H3K27ac在指定的年龄聚集在一起。（F）直方图显示，随着年龄的增长，A>F增强剂的可及性逐渐增加。（G）成体增强子元件的Homer分析。（H）所有增强子元件和成人特异性增强子元件的ROSE分析，由成人>胎儿H3K27ac确定。（I）表明造血转录因子结合在成体增强子元件上的直方图。（J）聚合ATAC-seq图谱如何反映染色质重塑的均匀或非均匀变化的模型。（K和L）单个成人的高度>胎儿ATAC-seq峰（K），或具有至少2倍动态范围的成人增强剂（L），显示归一化成人峰高度。
4 胎儿特异性增强剂在成年期保持可获得性和表观遗传学活性
接下来，研究者测试了胎儿增强子是否就像成人增强子被激活一样逐渐失活，而且不均匀。有趣的是，胎儿身份基因附近的增强子在成年后仍然可用，它们在H3K4me1和H3K27ac水平上仅表现出轻微的下降（图4A-4E）。几个胎儿身份基因，如HMGA2和Igf2bp2，在E16.5时，整个基因体的H3K4me1水平高于出生后8周（图4F和4G）。但在所有年龄段，远端增强子元素的分布非常相似。这提出了一个问题，即是否存在其他表观遗传机制来抑制成年HSCs中胎儿基因的表达。为了测试这一点，使用化学印迹来评估胎儿和成人启动子和增强子上的抑制性组蛋白3，赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）。与成体HSCs/HPC相比，成体启动子和增强子上调了胎儿HSCs/HPC中H3K27me3的表达，这与较低的表达水平一致（图4H）。相反，胎儿启动子和增强剂在两个年龄段的H3K27me3水平相同（图4H）。同样，数据表明，即使在成年发育阶段，胎儿增强子和启动子仍然具有表观遗传能力来驱动基因表达。研究者也确实观察到胎儿启动子中BCL11A位点的强烈富集（图4I）。BCL11A在出生后直接抑制胎儿血红蛋白启动子，它可能在其他胎儿特有的位点上发挥类似的功能。数据显示，新生儿HSC的发育伴随着成体增强子元件的广泛调试，而不是伴随着胎儿增强子元件的退役。
图4. 胎儿识别基因增强子在成人HSC和HPC中仍然可获得和启动。（A）ATAC-seq（红色）、H3K4me1（绿色）和H3K27ac（紫色）的增强子峰位于胎儿身份基因的100kB以内。（B-D）成人HSC和HPC中H3K4me1和H3K27ac的聚合水平。（E）聚合相同增强剂的ATAC-seq配置文件。（F和G）HMGA2和Igf2bp2基因体在胎儿HSCs和HPC中具有较高的H3K4me1。（H）H3K27me3在与胎儿和成人身份基因相关的启动子和增强子的聚集直方图。（I）胎儿身份基因启动子的Homer分析。
5 向成人翻译项目的过渡在出生前就开始了
研究者认为，新生儿的过渡可能开始于HSCs从胎肝迁移到骨髓时。为了测试这种可能性，研究者将P0肝和骨髓HSCs的单细胞转录本相互比较，并与取自E16.5肝和P7骨髓的HSCs进行比较（图5A）。如果骨髓的定位与胎儿到成人身份转变的开始一致，那么P0肝和骨髓造血干细胞将根据它们的位置而不是它们的年龄聚集（图5A）。相反，聚类和t-SNE可视化显示，P0骨髓和肝脏HSCs形成了与E16.5和P7HSCs不同的单个簇（图5B和5C）。研究者对E16.5、P0和P7 HPC执行了相同的分析（图5D和5E）。同样，P0骨髓和肝脏造血干细胞相互聚集，而不是与E16.5和P7造血干细胞聚集在一起（图5D和5E）。P0肝和骨髓HSC（和HPC）的成人同一性得分与P7 HSCs（和HPC）非常相似（图5F和5G）。因此，造血干细胞在出生前就开始从胎儿转录程序过渡到成人转录程序，无论它们位于肝脏还是骨髓。
图5. 从胎儿身份到成人身份的转变在出生前就开始了，与I型干扰素目标基因表达的瞬时脉冲一致。（A）位置相关和位置无关转换的scRNA-seq概况。（B-E）P0肝和骨髓HSCs（B和C）和HPC（D和E）聚集在一起，并从E16.5和P7 HSCs/HPC中分离出来。（F和G）成年期E16.5肝脏、P0肝脏、P0骨髓、和P7骨髓HSCs和HPCs。（H）反应组路径分析显示，P0、E16.5、P7HSCs的基因表达水平高于E16.5、P7HSCs。（I和J）可检测到IRF7、IFIT 1和Ifi27l2a表达的各年龄段的HSC和HPC的百分比。
6 晚期产前I型干扰素信号驱动成人HSC和HPC转录程序
在骨髓和肝脏HSCs/HPC的比较中，研究者注意到I型IFN靶基因，包括IRF7、Ifit1和Ifi27l2a，在P0的表达高于E16.5和P7（图5H-5J）。为了确定IFN靶基因何时被诱导，对E14.5、E16.5、E18.5、P0、P7、P14、和8周龄HSC和E16.5、P0、P7、P14、造血干细胞和E16.5、P0、P7、P7、P14和8周龄HPC进行了批量RNA-Seq。在E16.5和E18.5之间，HSCs诱导了大量的干扰素和炎症相关基因（图6A-6C）。这些基因中的大多数在E18.5和P0出现表达高峰。然后，在出生后，表达量保持在略低的水平。在HPC中也观察到了类似的模式。相对于E14.5和E16.5肝脏，E18.5肝脏中IFNA和IFNb蛋白水平升高了约3倍（图6D和6E），但母体血液中IFNA水平在这两个年龄段都非常低。在E18诱导干扰素靶基因需要IFNA/b受体，IFNAR（图6F和6G）。总之，这些数据表明，在E16和E18之间存在I型IFN信号的尖峰，它改变了HSCs和HPC中的基因表达。接下来，研究者试图确定干扰素的来源和刺激。孕酮信号已被证明在某些情况下可以抑制炎症，孕酮水平在妊娠晚期下降，但外源性黄体酮在E18没有抑制INFA和IFNb水平（图6D和6E）。胎儿肠道菌群多样性在E16和18岁之间显著扩大，增加了这种多样化刺激IFN表达的可能性。为了测试这种可能性，研究者在E14和E18测量了无菌小鼠的IFNA和IFNb水平。发现，即使在无菌条件下，E18的表达量也会增加（图6H和6I）。Ifit1和IRF7在无菌小鼠的HSC/HPC中表达增加（图6J）。总之，数据表明，分类干扰素信号是作为正常的、无菌的发育程序的一部分出现的，而不是对微生物组的变化做出反应。此前已经在小鼠和人类胎儿的皮肤、胸腺和脾脏中观察到IFNA/b的表达，包括在无菌条件下。为了确定一个潜在的来源，研究者对PAN-IFNA或IfNB1转录本进行了定量RT-PCR，使用了从E14和E18收获的各种器官的cDNA。检测到相对于E14肝脏，IFNA和IFNB在E18胎盘和胸腺中的表达水平较低，在E18皮肤中检测到高水平的IFNA表达（图6K）。
由于有几条证据表明I型干扰素信号是新生儿造血干细胞的发育开关，研究者测试了它是否调节成人身份基因的表达。研究者对野生型和Ifnar-/-小鼠的P0造血干细胞和造血干细胞进行RNA-Seq。许多成人身份基因依赖于Ifnar，特别是在造血干细胞中，但在造血干细胞中也有较小程度的依赖（图6L和6M）。因此，研究使用scRNA-seq来测试Ifnar-/-缺失是否会削弱P7 HPC中的成人转录程序（图6N）。与野生型HPC相比，Ifnar-/-HPC的同一性得分确实更像胎儿，而不是更像成人（图6N）。在P7，Ifnar-/-HPC的ATAC-SEQ图谱也比野生型HPC的ATAC-SEQ图谱更不像成人，这与向成人身份的延迟转变是一致的。
图6. I型干扰素信号在E18处尖峰并促进成体识别基因表达。（A）干扰素靶基因在特定年龄的造血干细胞中的表达。（B）IRF7、Ifi27l2a和Ifit1表达。（C）与E16.5相比，E18.5或P0造血干细胞中存在生物过程基因。（D和E）胎肝中IFNA和IFNb水平分别为E14.5、E16.5和E18.5。（F和G）在E14.5和E18.5的野生型和Ifnar-/-HPC中表达Ifit1和IRF7。（H）标准无病原体（SPF）或无菌（GF）母亲E14和E18胎肝中IFNA的表达。（I和J）Ifit1和IRF7在SPF和GF小鼠HSCs/HPC中的表达。（K）PAN-IFNA和IFNB1在指定组织中的表达，归一化到E14肝脏。（L）P0 HSCs和HPC中依赖Ifnar的成体身份基因的百分比。（M）依赖Ifnar的成人身份基因。（N）P7野生型和Ifnar-/-HPC的成人认同感得分。
7 I型干扰素信号驱动HPC的扩张，并从妊娠晚期开始增强主要组织相容性基因的表达
研究者检测了产前IFN峰是否对产期和出生后造血有调节作用。首先在E16和P0测量了HSC和HPC数量。在E16和P0，野生型和Ifnar-/-小鼠的HSC数量相似（图7A）。相反，野生型小鼠的HPC数量在E16和P0之间增加了3到4倍，但在Ifnar-/-小鼠中没有增加（图7B）。Ifnar-/-造血干细胞在P0和P14都有功能，这是通过竞争移植20个分选的造血干细胞来确定的（图7C）。在P7时，野生型和Ifnar-/-HSCs中溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的掺入相似，表明在没有IFN信号的情况下，向静止状态的转变不会延迟。此外，Ifnar缺失不会导致出生后的HSCs保留类似胎儿的谱系偏见，如腹膜B1a 。因此，产前晚期的IFN脉冲促进了HPC的扩增，但不会改变HSC的数量、增殖或功能。由于I型干扰素信号促进了HPC的扩张，测试了它是否也促进了其他承诺的祖细胞群体的扩张，以及这种影响是否具有年龄特异性。研究使用先前描述的表面标记表型分析了HSC、多能祖细胞（MPP）、HPC-1、HPC-2、粒细胞-单核细胞前体细胞（PGMs）和粒细胞-单核细胞前体细胞（GMP）的频率。从P0开始，Ifnar-/-小鼠的MPPs和HPC-1显著耗尽（图7E和7F），偏向淋巴的FLK2+HPC-1亚群也是如此（图7G）。HPC-2受到的影响较轻，PGM和GMP要么略有扩大，要么根本不受影响。因此，如果缺失，则选择性地损害MPP和HPC-1的扩张。为了进一步测试IFN信号是否调节更忠诚的祖细胞的承诺和基因表达，研究者对来自E16、P0、P14以及成年野生型和Ifnar-/-小鼠的C-kit+祖细胞进行了scRNA-SEQ（图7H）。使用Seurat对细胞进行聚类，并使用统一流形逼近和投影（UMAP）进行可视化。根据已知血统承诺基因的表达注释了簇（图7H）。ICGS产生非常相似的聚类结果。Ifnar-/-祖细胞在所有有血统偏见的群集中都有代表（图7I）。事实上，相对于每个年龄组中Ifnar-/-细胞的总体百分比，Ifnar缺失并没有丰富或耗尽这些群体（图7J）。因此，Ifnar缺失选择性地耗尽了未成熟的MPPs/HPC。Ifnar缺失的一个显著结果是与主要组织相容性复合体I型（MHC-I）抗原表达相关的基因在所有祖细胞簇上的表达减少（图7K）。在野生型祖细胞中，MHC-I基因的表达随着年龄的增长而增加，但如果nar缺失，这种变化就会变得迟钝，并可能掩盖这些祖细胞免受T细胞介导的破坏。综上所述，数据显示I型IFN信号促进HSCs和HPC中的成体转录程序，促进出生后期、产前和出生后HPC的扩张，并促进MHC-I在个体发育过程中的表达增加。
图7. Ifnar缺失会损害围产期HPC的扩张和MHC-I的表达，并阻止FLT3ITD驱动的HPC扩张。（A和B）E16和P0、野生型、Ifnar+/-和Ifnar-/-肝的HSC和HPC数。（C）P0野生型和Ifnar-/-造血干细胞的外周血重建。（D-G）E16、P0、P14和8周龄野生型和Ifnar-/-小鼠的HSC、MPP、HPC-1和Flk2+HPC-1频率。 （H）在E16、P0、P14和8周龄时，根据scRNA-seq转录本绘制谱系c-kit+细胞的UMAP图谱。（I）UMAP图，用颜色编码表示野生型和Ifnar-/-细胞。（J）每个有家族偏见的人群中Ifnar-/-细胞的归一化频率。（K）H2-D1在野生型和Ifnar-/-Lineage-C-kit+细胞中的表达。（l和M）P14、Flt3和Ifnar突变小鼠后肢HSC/HPC-1数量。（N）依赖Ifnar的Flt3ITD靶基因表达的变化。
8 I型干扰素信号增强出生后造血干细胞对FLT3ITD的敏感性
即新生儿I型干扰素信号是否可以调节对白血病突变的敏感性。研究者先前已经证明Flt3ITD突变会在出生后诱导HPC扩张和HSC耗尽，但不会在出生之前。为了测试新生IFN信号是否使HPC对FLT3ITD敏感，制备了复合突变体Flt3ITD/+；Ifnar-/-小鼠，并分析了P14时的HSC和HPC数量。Flt3ITD导致HSC耗竭，而与Ifnar基因型无关，但Flt3ITD驱动的HPC-1扩增在Ifnar-/-小鼠中完全挽救（图7L和7M）。先前的研究表明，HPC-1是FLT3ITD驱动的急性髓系白血病（AML）的起源细胞，因此测试了Ifnar缺失是否改变了这些细胞中FLT3ITD靶基因的表达。如果nar缺失挽救了FLT3ITD靶基因子集的表达，包括许多不是典型的IFN靶基因（图7N）。其中一些基因在AML的发病机制中发挥了重要作用。这些发现确立了I型干扰素信号不仅在正常造血中的作用，而且在FLT3ITD驱动的恶性造血中也发挥了作用。干扰素表达的正常时间变化可以确定在个体发育中，造血干细胞何时变得有能力转化。
结论
更多推荐
1 科研 |SCI ADV：平行单细胞转录组和染色质可及性测序揭示重编程轨迹的多样性
END