最新7.2分SCI，又见“免疫”分型，从投稿到接收不到一个月！ / 四六文摘

2021年9月发表的一篇文章：
“Characterization of hypoxia response patterns identified prognosis and immunotherapy response in bladder cancer”。

在本项研究中，作者使用无监督共识聚类方法综合评估了1343例膀胱癌(BLCA)患者的缺氧反应模式及其与基因组和临床病理特征的关联。确定了5种具有明显生存优势的缺氧反应模式(HPXclusters)，并使用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)和Cox回归算法构建HPXscore以表示缺氧反应模式。低HPXscore组的特点是免疫激活和高DNA损伤修复，被称为免疫炎症表型。高HPXscore组中观察到基质相关通路的激活，被认为可能是免疫排斥表型。此外，文章还证明HPXscore是一个独立预后因素，可以作为BLCA免疫治疗结果的良好预测指标。

发表杂志：Mol Ther Oncolytics.

影响因子：7.201

明明是乏氧，为什么说是免疫分型呢？大家可以跟我们介绍过的两篇文章做对比。

6.6分纯生信免疫分型，换个肿瘤可重复

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其实这些文章的本质是：基因集的单肿瘤分析。不管是免疫基因，还是乏氧基因，以及还可以扩展的各种各样的基因集，都可以用这个思路。那么该模式就有很大的可扩展性。

需要进行该模式分析的朋友，可以联系小编咨询

研究背景

膀胱癌(BLCA)是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。BLCA在组织学上被分为非肌肉浸润性BLCA(NMIBC)和肌肉浸润性BLCA(MIBC)。卡介苗(BCG)被批准为NMIBC治疗的一线免疫治疗药物，然而并非所有NMIBC患者都对BCG有反应，约50%的无反应者会复发或进展为MIBC，5年生存率<50%。肿瘤微环境(TME)包含多种细胞类型及分泌因子。在这样的微环境中，缺氧是细胞可塑性和肿瘤异质性的重要代谢因素。有研究报告指出，缺氧是通过激活缺氧/HIF-1α级联通路引发癌症侵袭和转移的重要触发因素。此外，化疗、放疗甚至免疫治疗敏感的癌细胞可能会转移到长期暴露于缺氧的耐药细胞中。

流程图

分析解读：

BLCA缺氧反应相关基因的共识聚类

①4个微阵列数据集（GEO：GSE13507、GSE32548、GSE32894和GSE48075）和TCGA测序数据集（TCGA-BLCA）被合并为meta-BLCA队列。

②UCSC Xena收集TCGA-BLCA数据集的样本信息。

③分子特征数据库(MSigDB)下载缺氧反应相关基因集。

④K-Means聚类算法识别不同的缺氧反应模式(HPXcluster)。

⑤使用R软件“limma”包识别每个模式之间的DEG。

⑥Kaplan-Meier对队列中不同缺氧反应模式进行生存分析。

结果：

下图B：meta-BLCA队列（GEO：GSE13507、GSE32548、GSE32894、GSE48075和TCGA-BLCA）中患者的共识矩阵，k=2-5，使用1000次K-Means聚类算法确保稳定性。

下图C：meta-BLCA队列中缺氧反应相关基因的分层聚类。行代表缺氧反应相关基因，列代表BLCA样本。红色代表高表达，蓝色代表低表达。

下图D：使用Kaplan-Meier曲线对meta-BLCA队列中不同缺氧反应模式的生存分析。HPXclusterE显示出明显优于所有其他缺氧反应模式的OS（对数秩检验，p=0.0133）。

不同缺氧反应模式下的TME免疫细胞浸润和生物学过程特征

①通过单样本基因集富集分析(ssGSEA)计算TME免疫浸润细胞的相对数量。

②使用R软件中的“GSVA”包执行ssGSEA算法识别不同缺氧反应表型之间的生物过程差异。

结果：

下图A：meta-BLCA队列中995名患者的TME免疫浸润细胞的分层聚类。

下图B：ssGSEA显示meta-BLCA队列中不同缺氧反应模式中生物途径的相对活性（包括免疫激活、抗原加工、错配修复和癌症通路等），热图用于可视化，红色代表通路相对激活，蓝色代表通路相对受到抑制。

下图C：meta-BLCA队列中5种不同缺氧反应模式之间的指示特征富集差异，以代表特定生物过程，包括基质激活相关特征、错配修复相关特征和免疫激活相关特征。

下图D：meta-BLCA队列中5种不同的缺氧反应模式之间MHC分子、共刺激分子和粘附分子的表达水平的差异。

TCGA-BLCA队列中的缺氧反应模式

①在TCGA-BLCA队列中对上述分析结果进行验证。

结果：

下图A：Kaplan-Meier生存曲线显示TCGA-BLCA队列中5种不同缺氧反应模式之间预后优势的差异（对数秩检验，p=0.015）。

下图B：TCGA-BLCA队列中5种不同缺氧反应模式中403名患者的TME浸润免疫细胞的分层聚类。

下图C：TCGA-BLCA队列中5种不同的缺氧反应模式之间MHC分子、共刺激分子和粘附分子的表达差异。

下图D：TCGA-BLCA队列中五种不同缺氧反应模式中免疫相关特征、基质相关特征和抗原加工机械相关特征的富集差异。

下图E：不同缺氧模式中DEG的基因本体论(GO)富集分析。

不同缺氧反应模式中的肿瘤体细胞突变

①使用R软件“maftools”和“complexheatmap”包研究BLCA中不同HPXclusters之间体细胞改变的分布差异。

结果：

下图A：前30个突变基因在BLCA的5种不同缺氧反应模式中的分布。瀑布图注释中指示了遗传改变类型。上部条形图表示TMB和总生存(OS)时间。左右条形图上的数字显示了每个基因在不同缺氧反应模式中的突变频率。

下图B：不同缺氧反应模式之间TMB的差异。框的上端和下端代表值的四分位距。方框中的线代表中值。Kruskal-Wallis检验用于比较每个模式之间的统计差异（p=0.0039）。

下图C：TCGA-BLCA队列中5种不同缺氧反应模式中错配修复相关特征的富集差异。框的上端和下端代表值的四分位距。方框中的线条表示中值，黑点表示异常值。通过单向方差分析测试了五种不同缺氧反应模式之间的统计差异。∗∗∗∗p<0.0001。

缺氧表型相关基因特征（HPXscore）的转录组特征和生物学特征

①本文建立了一个评分系统，称为缺氧表型相关基因特征（HPXscore），以评估BLCA患者的缺氧反应模式。

②从不同的HPXclusters中识别出DEGs并合并为meta-DEGs。

③使用单变量Cox回归分析提取具有显著预后差异的meta-DEG作为候选DEG进行进一步分析。

④应用R软件中的'glmnet”包的LASSO-Cox回归分析为BLCA构建最佳缺氧表型相关基因特征。

⑤每个样本的HPXscore由每个缺氧表型相关基因的相对表达及其相关的Cox系数定义。HPXscore=∑ni=1(coefi×Expri)，其中Expri是患者i签名中基因的相对表达，coefi是基因i的LASSO-Cox系数。

结果：

下图A：Kaplan-Meier生存曲线显示TCGA-BLCA队列中高和低HPXscore组之间预后优势的差异（对数秩检验，p<0.00001）。

下图B：HPXscore在5种不同缺氧反应模式中的分布。Kruskal-Wallis检验用于比较每个模式之间的统计差异（p=0.0022）。

下图C：TCGA-BLCA队列中高和低HPXscore组之间免疫激活相关特征和基质激活相关特征富集的差异。

下图D：HPXscore与TCGA-BLCA队列中与免疫和基质激活相关的基因特征之间的相关性。负相关用蓝色标记，正相关用红色标记。

下图E：Lund分类系统中不同分子亚型之间HPXscore的差异。Kruskal-Wallis检验用于比较不同分子亚型之间的统计差异（p=5.5e-5）。

下图F：TCGA-BLCA队列中高和低HPXscore组中Lund分子亚型的比例。使用Fisher精确检验测量统计差异（p=0.004467）。

下图G：冲积图显示TCGA-BLCA队列中HPXscore、HPXclusters、TMB、指示分子亚型和生命状态的变化。

下图H：TCGA-BLCA队列中高和低HPXscore组之间TMB的差异。使用Wilcoxon检验测量统计差异（p=1.3e-5）。

下图I：Kaplan-Meier生存曲线显示在TCGA-BLCA队列中由HPXscore和TMB分层的4组之间预后优势的差异（对数秩检验，p<0.00001）。

下图J：TCGA-BLCA队列中高和低HPXscore组之间的前30个突变基因的分布。上面的条形图表示TMB和OS时间。左右条形图上的数字显示了每个基因在不同缺氧反应模式中的突变频率。

HPXscore可作为BLCA的独立预后因素

①通过单变量和多变量Cox回归分析确定HPXscore是否能作为BLCA患者的临床独立预后因素并构建列线图。

结果：

下图A-B：HPXscore和临床病理学特征的单变量(A)和多变量(B)Cox分析的森林图。

下图C：基于5个独立预后因素预测3或5年OS的列线图。∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001。

下图D-E：用于预测3年和5年OS的列线图校准曲线。

下图F-G：基于3年和5年风险的5个独立预后因素的列线图决策曲线分析(DCA)。

HPXscore是ICI免疫疗法临床反应的预测生物标志物

①探讨HPXscore在IMvigor210(mUC)队列免疫治疗中的反应。

②Kaplan-Meier进行生存分析。

结果：

下图A：Kaplan-Meier生存曲线显示IMvigor210(mUC)队列中高和低HPXscore组之间预后优势的差异（对数秩检验，p<0.001）。

下图B：IMvigor210(mUC)队列中高和低HPXscore组之间指定基因特征的富集差异。

下图C：HPXscore与IMvigor210(mUC)队列中指示的基因特征之间的相关性。

下图D：IMvigor210(mUC)队列中Lund分类系统中不同分子亚型之间HPXscore的差异。Kruskal-Wallis检验用于比较不同分子亚型之间的统计差异（p=1.6e-9）。

下图E：IMvigor210(mUC)队列中高和低HPXscore组中Lund分子亚型的比例。使用Fisher精确检验测量统计差异（p=0.005722）。

下图F：冲积图显示IMvigor210(mUC)队列中HPXscore、TMB、指示分子亚型、生命状态、ICI总体反应和二元反应的变化。

结果：

下图A：IMvigor210(mUC)队列中高和低HPXscore组之间的TMB差异。使用Wilcoxon检验测量统计差异(p=0.0028)。

下图B：IMvigor210(mUC)队列中高和低HPXscore组中TMB水平的比例。使用Fisher精确检验测量统计差异（p=0.001859）。

下图C：Kaplan-Meier生存曲线显示了在IMvigor210(mUC)队列中由HPXscore和TMB分层的4组之间预后优势的差异（对数秩检验，p<0.00001）。

下图D-E：IMvigor210(mUC)队列中高和低HPXscore组之间免疫检查点(D)和免疫激活相关基因(E)的表达差异。

下图F：IMvigor210(mUC)队列中高和低HPXscore组之间免疫表型的比例。使用Fisher精确检验测量统计差异（p=0.033555）。

下图G：IMvigor210(mUC)队列中不同免疫表型之间HPXscore的差异。Kruskal-Wallis检验用于比较不同分子亚型之间的统计差异（p=0.00072）。

下图H：IMvigor210(mUC)队列中低或高HPXscore组对ICI免疫疗法有反应的患者比例。

下图I：不同ICI免疫治疗临床反应组之间HPXscore的差异。使用Kruskal-Wallis检验测量统计学差异(p=0.00028)。

下图J：测量HPXscore、TMB及其组合在IMvigor210(mUC)队列中的预测值的受试者工作特征(ROC)曲线。HPXscore、TMB和HPXscore与TMB组合的AUC分别为0.636、0.656和0.702。

小结：

在这项研究中，作者通过对1343例BLCA患者进行综合评估，确定了5种具有明显生存优势、TME免疫细胞浸润、临床病理和基因组特征的缺氧反应模式(HPXclusters)。同时，作者还构建了一套量化个体缺氧反应模式的评分系统—缺氧表型相关基因特征(HPXscore)。研究表明，HPXscore能够可靠地全面评估BLCA个体的缺氧反应模式，并且与临床、细胞和分子特征相关，包括临床分期、组织学亚型、TME免疫细胞浸润、免疫表型、分子亚型、遗传变异和肿瘤突变景观。此外，HPXscore可以作为BLCA患者预后的独立预后因素，以及对ICI免疫治疗的临床反应的预测因素。

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