生物质发酵产氢原理、进展和优缺点
目前，世界范围类96%的氢气来源于化石燃料，其生产过程中排放大量的温室气体。生物产氢过程包括:生物光解产氢，光发酵以及暗发酵[2，3]。与其他生物产氢过程相比，暗发酵的方式原料来源广泛，可利用多种工农业固体废弃物和废水[4]。此外，暗发酵产氢的速率高且无须太阳能的输入[3，5]。因此，从能源和环境角度，利用废弃生物质进行发酵产氢具有前景广阔。
基本原理
暗发酵生化途径如图6-1所示，以葡萄糖为例，在通过糖酵解途径转化为丙酮酸时，产生三磷酸腺苷( adenosine triphosphate，ATP)和还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)。丙酮酸进一步可通过两条途径转化为乙酰辅酶A。一种途径是通过严格厌氧菌( Clostridium属)代谢，同时产生还原铁氧还蛋白( reduced ferredoxin， Fared)。另一种是通过兼性厌氧菌( Enterobacter， Klebsiella)代谢，同时产生甲酸[7-9]。乙酰辅酶A在不同的微生物和环境条件下最终被转化为乙酸、丙酸、乳酸、丁酸等挥发性脂肪酸( volatile fatt! acids，VAs)和乙醇、丁醇等醇类。
图61葡萄糖的暗发酵产氫代谢途径[7~9]
从表6-1中的化学计量方程来看，1mol葡萄糖可以产生12mo氢气[式(6-1)][7]，然而此反应整个过程中自由能为正，在没有能量输入的情况下不能进行。1mol葡萄糖可以生成4moI氢气与2mo乙酸[式(6-2][11。乙酸进一步分解产生氢气需要外部的能量输入如光能(光发酵)、电能(燃料电池)等[11。如式(6-2)~式（6-4)所示，在碳水化合物的产氢发酵过程中，最常见的发酵产物是乙酸、丁酸和乙醇[8]。氢气产率与乙酸、丁酸的生成成正相关的关系，而乙醇的产生将降低氢气产率。当发酵产物为乳酸[式(6-5)]时氢气产率可忽略不计12。同型产乙酸[式(67)]耗氢产甲烷[式(6-8)]以及产丙酸[式(6-6)]的代谢途径将消耗产氢过程产生的氢气。根据以上的生化计量学方程，计算氢气摩尔产率(H2理论的)可以通过式(69)计算：
表6-1暗发酵产氧过程中不同发酵终产物情况下的化学计量学方程以及自由能
实际的氢气产率要低于生化计量学方程中的数值[8]。文献中报道的氢气产率的最高值低于3 mol H2/mol葡萄糖[9]。而在中温条件下，氢气产率约为2 mol H2/mol葡萄糖[]。这主要是由于:①葡萄糖在实际代谢过程中可能通过不产氢的生化途径进行，例如产乳酸等；②-部分的葡萄糖通过同化作用合成微生物的菌体被消耗；③计量学方程中的氢气产率是在均衝条件下得到的，实际上在接近理论值时，产氢反应速率将极大地降低从而使得后续的反应难以进行；④产生的氢气还可能被耗氢反应消耗，例如产丙酸、同型产乙酸、产甲烷反应等。
研究进展
目前对暗发酵产氢的研究主要集中于产氢接种物选择及处理方式，发酵pH值，水力停留时间( hydraulic retention time，HRT)，温度，原料和反应器构型等因素对产氢过程的影响。
接种物的选择以及处理方式
产氢的微生物包括严格厌氧菌( Clostridiaceae)、兼型厌氧菌( Enterobactericeae， Klebsiella)和好氧菌( Bacillus， Aeromonons Pseudomonos和b)。其中， clostridiun和Enterobacter是在暗发酵产氢中最为广泛应用的微生物。
尽管纯菌被广泛用于暗发酵产氢的硏究，然而混合菌种在实际中更为容易获得。此外，混合微生物种群间的相互协作使得其在处理复杂的生物质原料时更有活力。以兼性厌氧菌 Streptococcus和Kebsiella为例，可消耗环境中氧气从而为严格厌氧产氢菌 Clostridium的生存创造了更为适宜的环境[161。图62为混合菌种富集得到的以Clostridium状微生物为主的产氢微生物群落形态。
图6-2产氧颗粒污泥SEM图片[17]
Streptococcus菌还可以在颗粒污泥中与产氢菌 Clostridiun形成网状结构，从而起到强化颗粒污泥结构的作用[18]。而另外一些微生物可协助降解纤维素等复杂的原料，提高氢气产率[19]。混合菌种的来源丰富，包括消化污泥、活性污泥和环境中取得的土壤等。在些情况下，原料本身就含有产氢微生物，无须外接接种。
环境中得到的混合菌种作为接种物还需要进行处理。处理手段设定的依据主要是围绕着产氢菌 Clostridiun可形成芽孢这一特性进行的，通过接种物处理可使代谢途径向产氢方向进行，从而提高氢气产率。主要的接种物处理手段包括:热处理、酸处理、碱处理、化学处理、冻融处理、超声处理以及以上方式的结合。各种处理方法也被进行了比较。Wang等分别以酸处理、碱处理、热处理、曝气处理和化学处理(氯仿)后的消化污泥作为接种物进行了产氢批式试验，结果表明热处理在产氢潜力、产氢速率、基质降解速率各方面均最高。 Penteado等研究了热处理(90℃，10min)、酸处理(pH3，24h)对连续暗发酵产氢效果的影响，结果表明热处理后的氢气产率最高，而酸处理有助于获得稳定的产氢过程[23]。 Cheong等对比了热处理(105℃，2h)、酸处理(pH2，4h)、化学处理(溴乙基磺酸钠)对产氢的影响，结果表明酸处理能够获得最大的氢气产率。在 Argun等的研究中也证明了热处理相对于化学处理(氯仿)，其在氢气产率和产氢速率方面的优势[25]。Ros等对比了酸处理、碱处理、热处理和冻融处理，结果表明热处理在提升产氢方面效果最好。 Pendyala等对比了不同接种物来源，不同处理方法(热处理、酸处理、碱处理、化学处理)对产氢的影响，结果表明相比处理方法，接种物来源对产氢效果影响更显著[27]。综上所述，由于热处理和酸处理热处理效果好、方法简单可行等特点，是最为常用的处理手段。然而，大量的硏究结果证明仅仅接种物处理并不能完全抑制耗氢类微生物[8，28-30]，部分耗氢类微生物也可以形成芽孢从处理的过程中生存下来，例如产内酸和乳酸微生物( PropionibacteriumSporolactobacillus)。Si等发现以热处理厌氧污泥接种后的UASB和PBR中也有大量的产乳酸微生物的存在。
反应pH值
适宜的pH值将极大地提升产氢表现，低pH值可抑制耗氢的产甲烷活动。pH值的控制会影响代谢途径的改变，例如在pH值为4时，主要产物是丁酸，而当pH为中性时代谢产物则主要为乳酸和丙酸[7]。最佳的产氢pH值范围通常认为是在5~65之间。Chen等使用厌氧批式反应器研究了pH值(4.9，5.5，6.1，6.7)对产氢效果的影响，结果表明产氢最适宜的pH值是4.9。Fang等的研究结果则表明pH值在4~7之间(0.5为间隔)，氢气产率最高的pH值为5.5。然而部分的产氢批式试验是在中性pH下进行的。这可能与pH控制的方法有关，即初始值pH值和反应过程中的pH值是不同的控制指标。Lee等认为氢气产率并不是由初始pH值控制的，而是由产氢反应最终的pH值决定的。此外，最佳pH值的差异还与原料有关，糖产氢的最佳pH值为4.5~6，而蛋白质产氢的最佳pH值为8.5~10。产氢适宜的pH还与OLR相关。 Skonieczny等验证了基质浓度(1~3 g COD/L)和初始pH值(5.7~6.5)对产氢过程影响之间的关联性。Gnke等研究了基质浓度(1.5-44.8 g COD/L)和初始pH值(4.5~7.5)对产氢过程的影响，结果证明在pH值为5.5、基质浓度为7.5gCoD的情况下产氢效果最好。
温度
暗发酵产氢按照发酵温度的差别，可分为环境温度(20-25℃)、中温(35~39℃)、高温(40~60°C)以及超高温(>60℃)发酵。Tang等以0.5℃为间隔研究了30~50℃之间温度变化对牛场废水产氢的影响，结果以45℃的温度最佳。Wang等的研究结果较为相似，在20~55°C的区间内40C为产氢的最佳温度[39]。在更高的温度区间内(37~70℃C)以木薯酒糟为原料的产氢分批式试验证明60C为最佳温度。Gado等在以纤维素为原料的连续试验中发现与中温(37℃)发酵相比，超高温(80°C)和高温(55℃)条件下可抑制发酵过程中的产甲烷活动，从而提高氢气产率。
Valdez- Vazquez发现高温发酵(55℃)时的氢气浓度和氢气产率均高于中温发酵(35℃)[42]。以上研究都阐释了高温发酵时产氢表现要优于中温发酵，然而Sh等以海带为原料的批式发酵结果表明中温发酵的氢气产率[35℃，(61.3±2.0) mL/g TS]要优于高温发酵[50℃，(49.7±2.8) mL/g TS]以及超高温发酵[65°C，48.1±2.5) mL/g TS]。而在实际工程中，以环境温度发酵最为经济可行。Lin等在环境温度下实现了暗发酵产氢稳定连续的运行。
原料
暗发酵产氢原料广泛，包括制糖业垃圾、污泥、生活垃圾、市政垃圾、厨余垃圾、畜禽粪污和农作物秸秆等。 Kobayashi等研究了不同成分的市政垃圾的发酵产氢情况，结果表明碳水化合物含量高的原料产氢效果要优于蛋白质和脂质含量高的[45]。碳水化合物是主要的产氢来源，因此碳水化合物含量较高的原料，例如厨余垃圾、食品加工企业的废弃垃圾等，产氢过程中氢气浓度高、产氢速率快、氢气产率高。原料中的C/N比也对发酵产氢有重要的影响。 Argun等认为发酵产氢最优的C/N比为100/0.5[47]，这与Lmai等给出的140的最优C/N比接近。然而根据Lin等的研究，以蔗糖为原料进行产氢发酵时，最佳C/N比值为47。 Sreethawong等则得出的最佳C/N比值为17。因此，对于产氢过程最C/N此没有较为统一的结论，这可能与各试验中采取的接种物，原料以及pH值之间的差异有关。
磷在产氢过程中也起到了非常重要的作用，Lin等推荐使用磷酸盐代替碳酸盐作为缓冲剂以提升暗发酵产氢效果[51]。金属元素Mg、Na、Zn、Fe对发酵产氢有重要的影响[52]。适当补充钙离子可以提高产氢颗粒污泥系统中的微生物浓度，提升产氢速率。
反应器
目前已有多种反应器用于暗发酵产氢，包括连续搅拌反应器( continuous stirred tank reactor，CSTR)，滤床反应器( leaching bed reactor，LBR)，连续旋转鼓式反应器( continuous rotating drum，CRD)，厌氧序批式反应器( anaerobic sequencing batch reactor，ASBR)，上流式厌氧污泥床反应器(up- flow anaerobic sludge blanket，UASB)，填充床反应器( packed bed reactor，PBR)，载体颗粒污泥床反应器( carrier-induced granular sludge bed， CIGSB)以及厌氧流化床反应器（anaerobic fluidized bed reactor， AFBR）。
在CSTR中，污泥的停留时间与HRT相同，微生物均匀的悬浮在反应器内部，随着原料的流出而流出，因此当HRT较低时微生物将出现流失的情况从而导致反应器的崩溃。此外，在CSTR中，微生物浓度较低因此反应速率受到限制。尽管存在着反应速率较低的问题，CSTR适用于高固体浓度的原料的发酵。CRD反应器则由于外部旋转的方式使得反应器内部原料能够充分地混合，因此处理高固体浓度原料时优点突出。当原料总固体( total solid，TS)、挥发性固体( volatile solid，VS)浓度较低时，可使用厌氧高效反应器如UAsB、AFBR、PBR和CGSB等。这类反应器在反应器内部以生物膜或者颗粒污泥的形式富集了大量微生物，因此反应器效率较高。 Zhang等使用AFBR进行连续发酵产氢，HRT可缩短至0.125~3h，最高氢气产率可达7.6/(Lh)[541。 Chang采用了0.5~2hHRT运行PBR产氢最大的产氢速率可达1.32L/(Lh)。Ueno等使用UASB对制糖废水进行了产氢试验，在HRT为12h时获得了2.52moH2/mol葡萄糖的氢气产率[56]。Si等的研究结果表明，相比于PBR，UASB反应器的产氢效果更好[57]，这主要是对于不同的高效反应器，由于其不同的微生物富集模式，反应器内部的传质差异，其产氢也会出现显著的差异。
案例介绍
北京郊县农业废弃物厌氧发酵制取生物氢烷的中试工艺图如图6-3所示。在两阶段厌氧发酵前首先对玉米秸秆等农业废弃物进行预处理，即玉米秸秆经收集后进行粉碎；经粉碎处理后的秸秆在调配罐中与厌氧污泥混合，并进入连续搅拌反应器( continuous stirred tank reactor，CSTR)中进行厌氧发酵产氢气；产氢结束后物料经过固液分离存储于混合罐中，同时由泵输送至升流式厌氧污泥床( up-flow anaerobic sludge blanket，UASB)进行厌氧发酵产甲烷。通过两阶段厌氧发酵获得生物氢烷经收集后进行净化脱硫及加压储存于气柜中，后续可用于车载燃料或其他用途。同时，该过程产生的废弃物处理方式如下，固体废弃物(主要是产氢阶段结束后的残渣)将与蛭石、珍珠岩混合作为无士栽培基质；对于液体废弃物主要是产甲烷阶段结束后的发酵液)，部分发酵液将经泵流向调配罐用作污泥与秸秆混合，同时还有部分发酵液将在产甲烷相中循环，最后剩余的部分将作为液态肥料返田。
图6-3秸秆联产氡烷工艺流程图
现场实验装置如图6-4所示。其中，CSTR反应器有效容积为1m3，高径比为1.26:1，主体为焊接钢罐，内加聚氦酯涂层防腐，并采用循环水供热，热水源为—一个容积100L加热功率3KW的水罐，利用管道循环泵推动水热交换。UASB反应器有效容积为0.5m3，高径比为8:1，主体与 CSTR反应器一致，内加聚氨酯涂层防腐，并采用电热带加热方法，电热带螺旋缠绕发酵罐，外敷保温层。
图6-4秸秆联产氢烷中试现场布置图
以CSTR反应器作为产氢相反应器时，反应开始8h内产氢速率不断提升，并在8h前达到产氢速率的峰值，约12m3d，8h以后产氢速度一直下降并在发酵周期未期逐渐趋向零。并且产氢前后物料对比发现，产氢残渣中纤维素含量更高，可能是部分纤维素未能被微生物有效降解引起的；因此要提高氢气产量可以考虑强化原料的水解阶段
提高纤维素和半纤维素的生物转化效率。产甲烷阶段，UASB反应器COD去除率为(94.66±044)%，初始进水COD约为12g/L，每批次产甲烷过程中产气速度峰值相近。同时，产甲烷阶段受反应温度影响较为明显，因此在产甲烷过程中应该做好反应器的保温措施。在实验过程中氢气和甲烷产率分别为(25.20±1.03) L/kg TS和(95.98±3.53) L/kg TS；氢气和甲烷含量分别为(40.8±2.4)%和(79.7±4.0)%
优点与问题
暗发酵优点是相比其他生物产氢方式，速率快且无须太阳能的输入。此外，暗发酵产氢原料来源广泛，可利用工农业废水、固废进行氢气生产从而实现环境和能源的双重效益。然而，暗发酵产氢过程只是部分的利用了有机物，发酵剩余物中的有机物，包括多种挥发性脂肪酸、醇类等，其含量还很高，需要进一步地处理。因此，暗发酵产氢与产甲烷、光发酵产氢、微生物燃料电池等方法结合是目前硏究的重要方向。