细胞复苏实验步骤及注意事项

细胞复苏是指将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，分裂产生子细胞的过程。复苏后的细胞可重新进入细胞周期，获得细胞类型特异的生物学功能。复苏细胞一般采用快速融化法，以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化产生的水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

正所谓“万事开头难”，想必科研汪都有经历过为细胞复苏和保存提心吊胆的时刻，操作稍不注意，细胞便会全军覆没，悲惨收尾！

别急！让我们来为大家徒手表演“细胞复苏术”，原力唤醒你的细胞，包教包会！Let's Go!

细胞传代流程图

01

实验前准备

➡ 实验开始前，超净工作台开启紫外线照射30min后，打开通风机通风5min。

➡ 将离心机调节至250×g，4min。水浴锅调节至37℃恒温。取细胞完全培养基，放于水浴锅中预热。

➡ 消毒双手和超净工作台。取5mL以上细胞完全培养基放于15mL离心管中。

➡ 从液氮罐中取出细胞置-80℃冰箱中数分钟，让管中液氮挥发后，放入37℃的水浴锅中，不断晃动，使冻存液融化迅速、均匀。

注意：

管口处应高于水面，以免造成污染。整个解冻过程最好控制在1min以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，待1min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

02

制备细胞悬液

以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，用1mL细胞完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞，减少损失。轻轻吹打使冻存液与细胞完全培养基充分混匀，配平，将离心机调节至250×g，离心4min。

03

细胞计数

可采用细胞计数仪进行细胞计数，或血球计数板手动计数。

使用细胞计数仪需按相应的说明操作。血球计数板则先用75%无水乙醇溶液擦拭后，用无尘布擦净，盖上盖玻片，用移液枪吸取台盼蓝染液，按1∶1比例加入细胞悬液中（台盼蓝染液终浓度为0.04%）。从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙中。

注意：

不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则需重做。稍候片刻，再将计数板放在低倍镜下（10×10倍）观察计数。

04

细胞培养

➡ 离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果，加入2mL细胞完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

➡ 将细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，稍后加入足量细胞完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5mL。

➡ 摇匀细胞，放入37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。

➡ 复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的细胞完全培养基，之后每2天更换一次细胞完全培养基，直到细胞生长至90%汇合，即需传代。

注意事项

➡ 水浴锅温度：严格控制在37℃，且解冻时冻存管管口切勿浸没到水中；

➡ 解冻时间：2min以内，解冻时在水浴锅中快速晃动冻存管，管中残留一点固体时即可将其拿至超净台；

➡ 复苏接种密度：一管细胞（1×106个） 接种到1个T25（底面积25cm2）中，摇匀后置于37℃、5% CO2的培养箱中培养；

➡ 复苏时候的细胞相对脆弱，整个过程需尽量避免吹打时气泡的产生，重悬细胞时动作需轻柔、接种2h内不可移动培养皿/瓶、密切观察细胞的状态变化。否则，会严重影响细胞贴壁，造成细胞状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。

细胞复苏实验考验的是科研汪的耐心和细心，祝大家都能实验顺利~