酶促恒温扩增技术（ERA）在食品安全检测领域的应用
随着全球经济的发展，进口贸易的增多，食品安全检测也日趋严格。常用于食品安全检测的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，是目前大部分检测机构及医学实验室都在使用的常规技术。
然而该技术需要昂贵且精密的控温设备，耗费较长时间，在现场检测中不具备优势，因此，我们需要更加简便的技术来提高检测效率。
等温核酸扩增技术的问世为现场快速检测带来新的曙光。今天给大家介绍下先达基因的酶促恒温扩增技术 (ERA)。
本文对酶促恒温核酸扩增技术及其应用进行综述。ERA 技术全称酶促恒温核酸扩增技术，是聚合酶链式反应(PCR)的一种替代品，也是一种全新的升级，可准确、快速、便携地进行核酸检测分析。
ERA 与 PCR 扩增一样具有特异性，但速度快得多，结果通常在 5～ 10 min 生成。而且与 PCR 不同的是，ERA 反应不需要热变性，因此不需要昂贵的热循环设备。ERA对操作温度要求并不严格，反应在 37～42℃的温度下工作最优，比其他等温扩增技术需要的温度要低，能在广泛的环境温度下工作。
ERA可以在多种应用中取代PCR，如传染病诊断、食品安全检测、水产畜牧疫病检测等等，它非常适合于现场、护理点和其他设备缺乏的环境，特别是对于检测速度需求较高的情况下。
一、ERA 技术介绍
1、反应原理
酶促恒温扩增技术（ERA技术）是先达基因公司团队研发的具有全球自主知识产权等温核酸扩增技术，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的酶促恒温扩增体系。
模拟生物体遗传物质自身扩增复制的原理，通过蛋白定向进化、DNA与核酶亲和力成熟等技术对重组酶、核酸内切酶、DNA聚合酶等多酶体系进行改造，建立ERA扩增反应体系，使之将单分子DNA/RNA的特异性区段在5-10分钟内扩增10^9倍。
2、引物设计
ERA 引物设计原则：
(1) 引物长度最长是 35 bp，最好为 29～32bp，过短会影响重组酶活性。
(2) 5’端开头核苷酸最好是胞嘧啶，能促进扩增片段的重组，5’端避免出现3 到 5 个连续的聚鸟嘌呤。
(3) 3’端最好为胞嘧啶和鸟嘌呤，有助于聚合酶的稳定结合提升引物扩增性能。
(4) 引物中避免出现特殊序列，如避免出现回文序列和连续的重复结构。
(5) 引物设计时尽量避免容易形成发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。
(6) GC 含量过高(>60%)或过低(<40%)都不利于 ERA 扩增。
3、技术特点
ERA 技术与传统的 PCR 扩增相比在便捷性以及高效性上有显著的优势，与 PCR 技术相比有以下特点：
（1）反应能够在恒温条件下进行。尽管 ERA 的反应模式与 PCR 相似，但不同的是 PCR 反应需要加热使 DNA 模板变性，而 ERA 不需要，在 37～42℃的条件下，利用重组酶引物复合体扫描双链 DNA，促使 DNA 链上同源位点的互换。
（2）耗时短。ERA 反应速度快，能在 5～10 min 完成检测。在许多情况下，没有经过专门训练的人就可以采集样本，进行实验，并在半小时内得到结果。检测速度远胜于其他等温扩增技术。
（3）操作简单。ERA 扩增的基础体系含有 DNA 扩增所需的所有试剂，只需加入引物和模板就可以反应，不需要复杂的样品前处理，这大大提高了操作效率，避免繁琐的实验步骤带来可能性的误差。
（4）不受场地的限制。PCR 扩增需要专门的 PCR 仪，ERA 技术由于对温度要求低，甚至可以用人体温度进行，并可以在条件较为简陋的地方进行检测。
（5）高灵敏性。在复杂样品中，ERA 技术可以检测单拷贝的 DNA 和几十个或更少拷贝数的 RNA 分子，而不需要事先进行核酸纯化和富集。
4、操作过程
含有重组酶及聚合酶干粉的反应管中分别加入反应缓冲液、上下游引物以及模板 DNA，用纯水补至总体积，充分混匀，加入激活剂，上下颠倒 8～10 次混合均匀，瞬时离心后，可上机反应。
二、ERA 及衍生技术
1、基础型核酸扩增ERA法
基础型核酸扩增ERA法是一种快速、灵敏的检测方法。该技术不需要复杂的样品前处理环节，常温下就能够对样品中的目标基因进行扩增，简化了过程分析，在 15～20 min 的反应时长内能完成实验要求，远低于其他等温扩增技术的时长要求。它既不需要 PCR 所依赖的热循环仪器,也不像环介导等温扩增技术(LAMP)需要提前准备预变性的模板。
基础型核酸扩增ERA法具有快速、灵敏、简单等优点，是 ERA 系列技术的基础，最后的产物可用琼脂糖凝胶电泳等终点法进行结果检测。
2、实时荧光型核酸扩增ERA法
实时荧光型核酸扩增ERA，是 ERA 基础反应体系与荧光探针结合起来的一种联用技术。与荧光 PCR 比较，两者具有相同的灵敏度与特异性，然而实时荧光ERA 的检测过程所需时间明显短于实时荧光 PCR，即实时荧光ERA法所需时间是 10～15 min，实时荧光PCR 则需耗时约 90 min，且PCR 的实验操作设备较复杂、昂贵，而且所占空间大、不便携带。
此外，实时荧光 PCR 不仅需要一个热循环过程而且实验操作步骤复杂，而实时荧光ERA法实验操作温度在 37～42 ℃ 的恒温条件下就可进行，不需复杂的操作程序。用双标记寡核苷酸探针检测目标扩增，该探针的 5’末端含有荧光基团 （Tamra 或 FAM)，3’末端含有淬灭基团。当探针与被扩增的靶 DNA 结合时，外切酶切割基本位点，荧光基团和淬灭基团被分离，从而产生出与扩增目标 DNA 数量成正比的荧光信号，荧光强度也会随着其扩增而增强。荧光强度信号实时检测由荧光信号检测器或扫描仪完成，该试剂可配合先达基因生产的荧光恒温扩增仪GS8使用，实现恒温扩增与荧光信号检测于一体。
该技术敏感性强、特异性高，检测时间短，已有不少用户利用该技术建立呼吸道病原快速检测的方法。
3、 试纸型核酸扩增ERA法
ERA技术与试纸条侧向层析技术相结合，建立一种快速灵敏的现场检测系统。实现了利用侧向层析试纸条作为终点法对核酸扩增产物进行快速检测。该方法中引物用生物素进行了标记和探针用FAM 或FITC进行了标记，扩增产物结合到包埋有对应抗体的试纸条上并显色，从而实现检测。该方法无需特定检测设备，操作简单，能够快速直观获得检测结果。
试纸型ERA法检测结果能在横向流动试纸条上显示，裸眼便可观察，即使是非专业人员也可以直接分析结果，非常适用于现场快速检测，尤其在经济条件差资源缺乏的区域，具有更好的应用前景。
4、酶促扩增酶联免疫吸附技术(ERA-ELISA)
酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)是抗原抗体的特异性反应，指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
ERA-ELISA 技术是在 ERA 技术的基础上结合 ELISA 技术发展起来的用于检测核酸扩增产物的新型分析检测手段，综合了 ERA、ELISA 两种技术的特点，在特异性、灵敏性等方面表现出优异的特点、而且操作过程简单，结果不需要电泳检测和 ERA 产物纯化，较短时间内可以完成整个检测过程。
同时，能在数小时内对大量待检样品进行筛选和鉴定，适用于资源匮乏的现场快速检测是一种有效的联用检测技术。
三、ERA 技术在食品安全检测领域的应用
目前，ERA技术在涉及食品安全检测方面已有多项产品，并且在快速便捷检测等方面优于 PCR 检测。ERA 技术在食品安全领域的应用主要包括致病微生物、动物源性成分及转基因成分检测等方面。
1、食源性致病菌的 ERA 检测
沙门氏菌是引起世界各地食源性疾病暴发的最常见病原，许多流行病学调查将沙门氏菌爆发的源头归咎于家禽和家禽副产品，包括蛋类。先达基因建立了一种快速检测沙门氏菌的荧光检测方法，在 37～42 ℃下，仅需要 10 min 的扩增就能达到扩增子的检测阈值。
大量扩增后的产物能够与带有荧光标记的探针相结合，从而产生特定的荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况。样品中如果具有微量的沙门氏菌DNA存在时，则能够通过大量扩增后激发荧光信号，样本显示为阳性；如果样本中不含有沙门氏菌，仪器会判读为阴性。由此可见，ERA技术能够为食源性致病菌的检测提供一种简便的方法。
该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度。且不需要昂贵的设备，可作为野外条件下食物中沙门氏菌的检测试剂盒。
同时，先达基因还生产有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、李斯特氏菌、霍乱弧菌等一系类食品致病菌检测试剂盒。
2、肉类掺假检测
肉类食品是人们生活中最重要的生鲜类食品之一，随着生活水平的提高，对肉品质的需要也越来越高，近年来，国内外市场上的肉制品掺假事件频繁发生，这些不法行为不仅破坏了公平贸易，给消费者带来经济损失，更重要的是引起了宗教信仰、食品安全等方面的问题。
先达基因科技有限公司自主开发的核酸检测技术实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，可对各类肉源性成分核酸特异基因片段进行扩增及定性检测，通过实时扩增曲线，在短时间内判断样品中是否含有其肉源性成分。ERA技术在动物源性检测方面具有简单高效等优点，为市售生鲜肉制品掺假提供了快速便捷的检测方法。
3、转基因检测
随着转基因技术的不断发展，其在农业技术方面的应用也越来越广泛，转基因食品也走向市场， 在转基因食品的监测方面，监管部门也面临越来越大的压力。
先达基因自主开发的核酸检测技术实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，可对转基因农作物PAT基因片段进行扩增及定性检测，通过实时扩增曲线，在短时间内判断样品中是否含有转基因农作物PAT基因成分。该方法可在 15～25 min 可靠地检测出样品中的 100 个拷贝的目标分子。这种新的扩增方法大大缩短了检测时间，简化了反应过程，为转基因作物的快速检测提供了一种快速有效的方法。
本产品可用于食品生产加工企业对产品中潜在的转基因农作物PAT基因进行快速检测与筛查；国家、地方食品药品监督管理单位对抽样食品中潜在的转基因农作物NOS基因进行快速检测；重大活动中的食品安全保障；食品安全突发事件中的快速检测等。
这种现场检测方法同样适用于未经训练的人员对样品进行快速简单的测试。ERA技术为转基因食品的检测提供了快速便捷的方法。
四、结论
ERA 恒温扩增技术具有许多优点。这种反应没有热循环的需要，可使用简单设备，如小型加热器等，价格低廉，可以进行最低限度的维护控制。具体来说，ERA 具有恒温、较低温度、扩增时间短、可靠性和简单性等特点。核酸扩增产物的测定还具有灵敏度高等优点，在食品安全核酸检测领域具有一定的应用价值。
它提供了一种能够检测潜在食物威胁因素的方法，如过掺假肉、转基因生物或病原体。传统检测技术由于耗时长，设备复杂，因此不利于现场快速检测，已不能满足食品安全检测的更高需求，因此建立一种快速便携、灵敏、特异的检测方法十分重要。ERA 作为一个新兴的分子检测技术， 迄今为止，不仅在医药学等方面应用较多，而且在食品安全检测方面的研究也初有成效，随着 ERA 技术不断地应用与研发，未来 ERA 将朝更加快速、便携、敏感、特异的方向发展，给食品安全检测的研究带来新的方向。