基因治疗中质粒规模化生产的挑战及解决方案

基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗疾病目的。广义上说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术，如CAR-T、溶瘤疗法等。基因治疗在对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病有重要的应用，是当代生命科学中最有前途的热点领域之一，是未来医学的希望。众多的跨国制药公司和基因治疗专业公司纷纷斥巨资加大研发力度，抢占制药领域的制高点。

腺相关病毒和慢病毒是基因治疗最为常用的载体，生产这两种载体都需要质粒作为原材料。在制药水平，每年需要大量的符合质量要求的质粒，以满足当前基因治疗领域的市场需求。然而，目前质粒大规模生产及纯化还存在诸多的挑战（见表1）

01质粒商业化生产挑战

质粒通常在重组的大肠杆菌（E.coli）中发酵生产，其纯化工艺一般包括菌体收获、裂解、菌体碎片/固体分离、层析以及澄清和浓缩等步骤，最后得到符合质量要求的质粒。

图1. 质粒DNA的生产

1.1  发酵

为满足商业化要求，质粒发酵通常的方法是尽可能增加大肠杆菌的发酵密度，在高密度培养的发酵中，具有高氧传递速率（OTR）的生物反应器对质粒生产具有重要意义，如溶氧不足不仅可降低质粒产量，还可导致质粒结构的不稳定性，导致开环、聚集体比例提高，这为后续纯化带来很大困难。将发酵溶氧等因素进行优化后质粒产量可达摇瓶的10-50倍。

1.2  裂解

离心或微滤等技术用于收集发酵液中大肠杆菌。后通过裂解，如碱性裂解或热裂解来释放质粒。碱裂解法是目前应用最为广泛的方法，将菌液置于碱性强阴离子溶液中，使宿主DNA 和蛋白质变性，质粒因其特有的环状超螺旋结构，仅破坏碱基对之间的氢键。当pH恢复至中性质粒会发生复性，而宿主DNA不能完全复性，与菌体碎片和已变性的蛋白质结合在一起，采用离心法就能将质粒从菌体裂解液中分离出来。碱裂解是质粒纯化中的关键步骤，也是常出现问题的步骤，局部pH大于12.5会导致质粒不可逆变性。另外，碱裂解控制不当也会导致质粒构型发生变化，影响其转染效率及表达活性。

商业化大规模裂解过程很难控制，工艺重复性差，并可能导致质粒的较大损失。另外该阶段质粒对剪切更敏感，如控制措施不当，超螺旋质粒可能转化为开环或线性变体，影响其质量。

1.3  纯化

大肠杆菌裂解释放大量RNA、gDNA片段、蛋白、内毒素及质粒变体。一些分子与质粒DNA的比较相似，使得纯化变得困难。层析法是大规模纯化质粒DNA 常用方法，亲和层析可用于分离开环及线性质粒；离子交换层析可用于质粒不同拓扑形态的分离，在药用质粒纯化中应用比较广泛；体积排阻层析可分离出一些小分子的杂质；为提高纯化效果常采用RNase将高分子量RNA降解为寡核苷酸。在基因治疗中需控制质粒宿主DNA、RNA、HCP、内毒素等残留，在质粒纯化中常存在内毒素残留超标等问题。在DNA疫苗中质粒直接注入人体内，这对通过纯化工艺控制上述杂质残留提出了更高的要求，也为纯化工艺提出新的挑战。

1.4  质量研究

质粒作为胞内生物大分子，生产中存在大量杂质，如基因组DNA、RNA、菌体蛋白、内毒素、菌体多糖等。在质粒终产品中的杂质或均不利于转染或增加患者安全性风险，因此，需要将质粒中的杂质控制在一定水平。

质粒质量研究中心一个较为棘手的问题是质粒构型分析，典型的质粒有3种不同的构型：共价闭合环形的超螺旋结构（SC构型）；一条链完整，另一条链上有一至数个缺口的开环所呈现的开环构型（OC构型）；双链均断裂所呈现的线性构型（L构型）。

OC构型及L构型由于单链或双链断裂导致质粒尺寸增大，导致转染效率或活性低下，故需要控制其比例。常用的质粒构型测定方法有琼脂糖凝胶电泳法（AGE）、离子交换法及毛细管凝胶电泳（CGE）。AGE法能分离SC、OC及L构型，但只是一种半定量分析方法，分辨率有限；离子交换法可以实现不同拓扑形态质粒的分离，分析质粒的含量和拓扑形态，检测质粒的纯度和浓度。质粒不同的拓扑结构也可用毛细管凝胶电泳（CGE）进行区分。

02 解决方案

无锡生基医药科技有限公司（“生基医药”）是药明康德旗下专注于细胞和基因疗法的CTDMO，致力于赋能全球客户、加速细胞和基因治疗产品研发生产进程。

Eppendorf是一家领先的生命科学公司，专注于研发和销售实验室的常规仪器、耗材和服务。Eppendorf 生物工艺部门提供用于培养哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母和真菌的生物过程系统，可覆盖实验室研发、中试放大以及商业化生产的工艺需求。

在本次Eppendorf与无锡生基医药共同合作举办系列研讨会中，您可以深入了解质粒大规模制备及高密度细胞培养的工艺开发流程，分享工艺流程中的质量控制关键因素，从而提升最终产物的质量和产量。

03 系列研讨会

第一期研讨会时间：5月27日 19:30-21:00

19:30  从研究到商业化的质粒制备及供应整体解决方案

邹萍

生产运营高级主任，无锡生基医药科技有限公司

20:00 质粒制备工艺中溶解氧对发酵的影响及控制

Dr. Ying Yang 

Senior Research Scientist，Bioprocess Center Eppendorf, Inc.

20:30 Q&A

21:00 活动结束

在本次讲座中，您将能了解到 

1. 质粒DNA载体大规模制备上游和下游技术，研究、临床及商业化各阶段质粒DNA载体的生产质量控制要求和控制策略

2. OXGENE质粒现货解决方案，赋能客户加速慢病毒和腺相关病毒等产品的开发

3.  质粒的高效制备基于高密度的微生物发酵，溶解氧（DO）在发酵中起到重要作用

4. 具有高氧传递速率（OTR）的生物反应器可支持不同规模的微生物生长并保证产品产量

邹萍

生产运营高级主任，无锡生基医药科技有限公司

邹萍，毕业于华东理工大学生物化学专业，于2020年加入生基医药，担任生基医药生产运营负责人，负责惠山基地生产运营工作。她在生物制药领域具有15年以上抗体类药物的技术开发和生产质量管理经验，擅长蛋白抗体类药物的工艺放大、技术转移、GMP体系建设和项目生产运营管理。在加入生基医药之前，曾供职于三生国健药业（上海）股份有限公司，历任质量保证副总监和生产总监职位，并参与及承担过多项国家和上海市重大课题。

 Dr.Ying Yang

Senior Research Scientist，

Bioprocess Center Eppendorf, Inc.

Dr. Ying Yang joined Eppendorf in 2017 as a Senior Research Scientist working in the Bioprocess Applications Lab. She earned her PhD in Biotechnology from Worcester Polytechnic Institute in Worcester, MA and Masters in Biological and Agricultural Engineering from North Carolina State University in Raleigh, NC.Later as a post-doc researcher, she participated in a USDA Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant funded project at Louisiana State University Agricultural Center. Over the years, she has built her research expertise in applied microbiology focusing on fermentation of bacteria, fungi,and microalgae from both academia and the bioprocess industry.