探究干细胞五大特点：（三）高活性
干细胞是生命的起源细胞，凭借其自身特点和独特功能，已经在美容抗衰、疾病治疗等领域发挥重要作用，而本次抗击新冠肺炎的临床应用中，干细胞以出色的成绩，又让我们重新认识了它，更激起了大家对干细胞更多优势特点的好奇。
本系列撰文《干细胞的五大特点》，将带您继续深入探究干细胞临床应用价值的背后机理，从分子层面，探究干细胞自身特点：自我复制、低免疫原性、高活性、趋炎性、不成瘤等。干细胞凭借自身独特优势，在实际临床实践中发挥了巨大应用价值，并且拥有更为广阔的商业价值。
每种细胞都有一定的自我更新能力，就如昨天文中提到的：皮肤上皮细胞每28天需要复制、更新一次；免疫细胞每7-14天换代一次；小肠上皮细胞更新频率更快，每2-3天更新一次。
但不是每种细胞，都有干细胞那样的高活性。
因此，普通细胞和干细胞之间，还是有很大差距的。
干细胞的高活性体现在，这样一类具有无限或者永生的自我更新能力，可以多向分化和旁分泌的细胞，其实拥有着两个方面的能力，干性和功能性。
如果干细胞的干性越强，证明它未来的分化能力越强，代表它现在还是一个功能性很低的细胞。而相反，干细胞的干性越弱，证明它的分化能力越弱，则代表它现在是一个功能较强的细胞。
虽然这两个方面的能力是天平的两端，并不能兼得，但也反映了每一个干细胞的高活性，“我可以在适宜的条件下，先保持两者的平衡，调整最佳状态，再切换自己的走向，实现价值”。
下面，就让我们来看一看，如何预测干细胞的高活性？
01
干细胞高活性的预测
一项刊登于《EbioMedicine》杂志上的研究论文中，来自斯克利普斯研究所的研究者通过研究，首次开发了一种方法，该方法通过监测某种分子，可以预测特殊类型的干细胞的活性。在当前超过500种的基于干细胞疗法的临床应用中，可以有效评估这些疗法的安全及合理性。
研究者检测了不同人类身体中TWIST1分子的水平，他们发现，如下图所示，左侧是与TWIST1分子上调相关的一些基因，它们会和一些具体的细胞功能相关，比如血管生成，因此高水平的TWIST1可以产生巨大的血管生成效应，从而促进新生血管生长（功能性）。下图右侧是与TWIST1分子下调相关的一些基因，它们会和一些免疫功能相关，因此低水平的TWIST1可以产生较强的抗炎性和免疫抑制效应（干性）。
比如，目前很多临床试验都在利用间质干细胞治疗炎症引起的疾病，而其中，血管发生是疾病进展的关键过程，因此携带高水平TWIST1的干细胞或许并不十分有益，那就可以偏向选择一些TWIST1低水平的干细胞。这种新开发的预测工具就可以准确预测一些疾病迹象和禁忌情况，更好地在临床中应用干细胞的活性。
02
干细胞高活性和细胞代次
临床应用干细胞疗法的时候，尤其是间充质干细胞疗法，面临一个实际操作的选择，那就是“使用第几代的干细胞最合适？”。
“细胞代次”的问题，其实就是在追求干细胞的高活性。因为和人一样，干细胞在体外培养扩增的过程，因为体外的环境无法比拟体内，因此干细胞也经历了由年轻到衰老，由高活性到活性丧失的过程。
需要区别的是，“细胞代次”只是代表干细胞在体外培养中的传代次数，原始提取自脐带、胎盘、羊膜的就是P0代干细胞，传一代就是P1代干细胞，以此类推。因此细胞代次和干细胞分裂次数之间并没有相关性，P1代干细胞并不表示干细胞在体外扩增了1倍。但这不妨碍我们用“细胞代次”来表示干细胞的活性，再综合考虑安全性以及生产能力来考虑最佳治疗方案。
所以，到底哪一代的干细胞最能代表临床应用的干细胞高活性呢？
03
干细胞不宜超过第7代
除了根据具体的临床情况，选择偏向哪个方面的干细胞能力之外，干细胞的细胞代次，也是非常影响干细胞的活性，不能过于前期，也不能过于后期。
对UC-MSC（脐带间充质干细胞），AD-MSC（脂肪间充质干细胞）和PMSC（胎盘间充质干细胞）的P1/3/5/7/10/13/17/20代细胞进行染色体核型分析，结果发现，间充质干细胞在传代过程中，染色体核型均未见异常，没有缺失、易位和倒位等变化。
△ 如图：A代表UC-MSC的P10染色体核型是46 XX，图B代表AD-MSC的P10染色体核型是46 XX，图C代表PMSC的P10染色体核型是46 XY。
对UC-MSC，AD-MSC和PMSC的P1/3/5/7/10/13/17/20代细胞进行了7个基因的表达量检测，结果如下图所示，抑癌基因P16和P21，在P7代之前呈上调趋势。P53、CCNE、Nanog和TERT基因，在P7代之前保持基本稳定。原癌基因K-ras基因在P7代之前略有下降。
总体来看，在P7代以前，三种间充质干细胞的基因表达在各自传代过程中有一些差异，但差异不算很大。
对UC-MSC，AD-MSC和PMSC的P1/3/5/7/10/13/17/20代细胞进行了bEGF、VEGF165、EGF、NGF、LIF和HGF等细胞因子的检测，如下图所示，虽然三种来源的干细胞之间分泌的细胞因子不同，但在P7代之前，各自的细胞因子含量基本保持稳定。
因此，综合来看，三种来源的间充质干细胞在体外传代至P7代以前，我们可以认为其遗传特性基本稳定，生物学特性有一定的差异，但差异不大，也可以认为基本稳定。
在遗传背景，生物学特性稳定的基础之上，我们还要考察细胞的增殖能力和凋亡情况。
如下图所示，观察体外培养P3/5/7/10/15代细胞的生长曲线，可以发现，这些细胞代次的干细胞生长曲线是相似的，传代接种0h～24h细胞处于滞留期，增殖不明显；第24h～96h进入对数生长期，细胞增殖加速；96h后进入平台期。P15代细胞生长曲线，全程细胞几乎处于滞留期，细胞增殖缓慢，未见对数生长期。
考察增殖能力的时候，还会考虑细胞周期的比值，尤其是（G2/M）/（G0/G1）的比例，比例越高代表增殖能力越高。如下图所示，P3、P5、P7都在合理范围内。P10、P15明显增殖能力变弱。所以从生长增殖来考虑，P7代以前是不错的。
当采用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I 检测不同代次细胞的凋亡差异情况时，从流式检测结果来看，随着传代次数的增加，凋亡细胞比例在P7之后有上升趋势。所以从应用细胞的有效性上考虑，应当以P7代之前为主，尽量少含有凋亡细胞。
干细胞高活性应用的细胞代次是有上限的，那是不是意味着越早期的干细胞，临床应用效果越好呢？当然不是了，有上限也会有下限，在这个范围之内，才是干细胞高活性的最优选择。
04
干细胞不宜短于3代
当我们观察间充质干细胞的具体细胞形态时，如下图，可以明显观察到体外P8代细胞的状态远远不如P3代，比如细胞会变大，梭形变化，出现一些不规则形状的细胞形态等，因此随着细胞代次的增加，体外细胞的状态理论上是一代不如一代的。
△ 图a代表P3代，图b代表P8代
如果熟悉细胞体外扩增培养的步骤，就不难理解了。
因为培养容器的体积限制，细胞的体外扩增，每一次都要用0.25%的胰酶来消化长满的、贴壁的细胞，再更换新鲜的细胞培养液，并将经过离心的细胞，按照一定的稀释比例，重新投放进入新鲜的细胞培液中，扩增。
每一次细胞由少长满，再稀释，由少长满的过程，大概要经过2-3天。那么，不难想象，每一次的胰酶消化，每一次的离心，每一次的稀释，都是对干细胞状态的一次影响。
再结合具体的临床应用，我们不必使用P3代以前的干细胞，也能够保持干细胞的高活性。比如下图。
将不同代次（P5/10/20）的间充质干细胞以同样密度接种于6孔板中，每天分别收集3孔不同代次的间充质干细胞，计数并绘制生长曲线，可以看到P5代的增殖效率已经很高了。这是不必使用P3代以前的原因，还有几点原因是我们不能使用P3代以前的干细胞。
第一，太早期的干细胞，比如P0代的原始干细胞，它们刚刚从组织中被新鲜取出，还来不及进一步净化，来不及检测各种污染物的存在情况，那么就有可能在提取的过程中感染了某些细菌、病毒、微生物。这样的干细胞虽然活性高了，但产品的安全保障也没有了。
第二，越早期的干细胞，没有经历过体外的培养扩增，它的干细胞客观含量是很低的，可能远远达不到干细胞疗法的使用标准。哪怕其它各项活性都很好，巧妇也难为无米之炊。因此，一次干细胞疗法的靠谱应用，“质”和“量”都要兼顾的。
在不影响干细胞高活性的前提基础上，综合考虑干细胞疗法的临床应用，包括质量和安全性等，我们建议干细胞的最佳细胞代次是3~7代。
参考文献：
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