【干货分享】外泌体提取的3种超速离心方法（内含赠书福利）

文末有《细胞外囊泡：基础研究与临床应用》书籍赠送！

最近小编的一位朋友投一篇外泌体的文章，五分左右的杂志，审稿却对manuscript中用的“exosome”一词表示怀疑，可是朋友用的是目前很公认的超速提取的方法。可见人们对外泌体领域的研究方法要求越来越高了。但是，目前确实没有可以得到百分之百pure的外泌体，超速离心仍然是最受公认的外泌体提取方法。

为了满足大家不同层次的外泌体提取方法的要求。本文给大家提供3种基于超速离心的外泌体提取protocol。

1.基础版——普通超速离心

该方法此前在外泌体之家已经提到过非常多次了。该方法又称为差速离心法。简单说低速离心去除死细胞、大的细胞碎片；高速离心去除小的细胞碎片、大囊泡等；最后超速离心得到外泌体。各文献中具体的各阶段离心力和时间大同小异，主要可以参考参考文献1。

超速离心提取外泌体流程示意图

详细protocol可见进阶版中的第1-5步。

2.进阶版——基于蔗糖垫的超速离心

如果对外泌体的纯度要求较高，但又不想做密度梯度离心那么麻烦，大家可以用基于蔗糖垫的超速离心方法。这里以提取细胞上清中外泌体为例，给大家详细提供一个protocol。

蔗糖垫示意图

1. 新鲜收集细胞上清，以300 g、4度、离心10 min，去除细胞、死细胞，离心后取上清；

2. 2000 g、4度、离心10 min，去除细胞碎片，离心后取上清；

   注：常有小伙伴问细胞上清不能及时处理，该怎么保存。此步骤后的上清可于4度保存，48 h内提取外泌体为佳；若需长期保存，可冻存于-80度，解冻时4度慢融。切记不经一二步离心去除细胞、死细胞、细胞碎片就直接保存，会严重影响后面提取的外泌体的组分。

3. 10000 g，4度、离心30 min，去除大膜泡，离心后取上清；

   注：若采用普通超离法进入步骤4；若采用蔗糖垫超速离心法进入步骤6。

4. 普通超离法。以Beckman超速离心机为例，严格按照超速离心操作步骤进行，将超速离心管装入准备好的细胞上清至距离心管口2-3 mm处；120000 g、4度、离心70 min。离心后，尽可能去除上清（注意小心操作，很容易将富含外泌体pellet丢失），用所需要的溶液（如DPBS、若提取蛋白用蛋白裂解液、若提取核酸用核酸裂解液等）重悬底部沉淀。即得外泌体（的蛋白/核酸）样本。

5. 此步骤可选。如步骤4中无法去干净上清或希望外泌体纯度更好些，可用DPBS重悬后再次超离。离心后，尽可能去除上清（注意小心操作，很容易将富含外泌体pellet丢失），用所需要的溶液（如DPBS、若提取蛋白用蛋白裂解液、若提取核酸用核酸裂解液等）重悬底部沉淀。即得外泌体（的蛋白/核酸）样本。

6. 蔗糖垫超速离心法。将管底铺上3-4 mL 30%的重水蔗糖垫，再小心将细胞上清铺在蔗糖垫上（可用胶头滴管操作，较为方便快速），同样液体须装至距离心管口2-3 mm处。120000 g、4度、离心70 min。

7. 超离结束后，尽可能去除蔗糖垫上面的细胞上清，将底部蔗糖层用适量DPBS稀释。

8. 将DPBS稀释的蔗糖层溶液装入新的超速离心管，120000 g、4度、离心70 min。离心后，尽可能去除上清（注意小心操作，很容易将富含外泌体pellet丢失），用所需要的溶液（如DPBS、若提取蛋白用蛋白裂解液、若提取核酸用核酸裂解液等）重悬底部沉淀。即得外泌体（的蛋白/核酸）样本。

注：可能很多人会问蔗糖垫怎么弄啊？麻不麻烦…其实很简单，找个商家卖重水，即D2O；在找个商家卖蔗糖，超简单。然后按照质量/体积比30%，称量蔗糖，定容，过滤除菌，搞定。一次可以多配些，比如200 mL，分装使用。配的体积大，浓度偏差会小些。

3.高级版——基于密度梯度的超速离心

这个就是对外泌体纯度要求非常高的了。其中超离的步骤同样参见进阶版中的第1-5步。主要区别就在于密度梯度怎么弄了。

碘克沙醇密度梯度离心工作流程示意图

密度梯度的制作目前主要利用蔗糖或者碘克沙醇（iodixanol）。以碘克沙醇为例，可以买到OptiPrep density gradient medium，按照40%、20%、10%、5%配好，小心依次铺到离心管中，最上层加浓缩的细胞上清或血浆/清。

在5-10-20-40%碘克沙醇密度梯度中，外泌体主要富集在第6、7个fractions中

有小伙伴会对用什么类型转子有疑问。超速离心常用两种转子：水平转子和固定角转子。

水平转子也叫水平转头（如下图左）。在离心过程中，离心管与轴之间的角度从开始 0°变成90°，停止时又成为0°。

固定角转子也叫定角转子、定角转头（如下图右）。在离心过程中，离心管与轴之间的角度是固定的，通常在20°到45°之间。离心时，样品会首先沉淀到离心管侧壁，然后下滑至离心管的外侧底部聚集。

水平转子（左）与定角转子（右）

这2种转子区别，大家看下面的图解就明白了。

所以，普通超速离心既可以用定角转子也可以用水平转子，如果离心管透明度不高，定角的离心最后沉淀在管底的侧面，有易于观察的优势（外泌体量多可肉眼观察时）；但是主要还是看个人习惯。蔗糖垫超离和密度梯度离心需要用水平转子。

此外，提取细胞上清外泌体时由于液体体积大，可以选择容量较大的转子（如Beckman的Type 70 Ti 、Type 45 Ti、SW 32 Ti等）；用于清洗和富集可以选择容量小的转子（如SW 41 Ti、SW 60 Ti等），利于外泌体沉淀的后续操作。

无法得到百分之百pure外泌体的问题与审稿人日益增长的要求之间的矛盾，确实是外泌体研究的重要矛盾之一。最新那篇Science杂志上的综述也提到，在建立用于研究外泌体的纯化和分析流程时，挑战仍然存在，我们得到的可能是包括外泌体的EV异质群体。目前某些研究发现可能反映的是外泌体与其他EV混合的结果。但是，至少我们要尽可能排除soluble factor的影响。

Anyway，如果我们利用当前较为公认的分离方法，在面对审稿人的质疑时，我们也能据理力争一下；甚至就像小编的朋友那样把“exosomes”改成“extracellular vesicles”，审稿人不能说啥。

参考文献：

1. Thery, C., et al. (2006). "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Curr Protoc Cell Biol Chapter 3: Unit 3 22.
2. Iwai, K., et al. (2016). "Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations." J Extracell Vesicles 5: 30829.
3. Li, K., et al. (2018). "Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC): A Refined and High Performance Method for the Isolation, Characterization, and Use of Exosomes." Methods Mol Biol 1740: 69-83.
4. Kowal, J., et al. (2016). "Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes." Proc Natl Acad Sci U S A 113(8): E968-977.