【套路】用沉淀盒子分离外泌体的朋友看过来。reviewer质疑外泌体不纯怎么办

昨天hzangs写了一个废话连篇的推文，估计大家看着都烦。hzangs在这里表示歉意，哈哈。今天总结了一下要点，重新推送给大家，昨天耐着性子读完了的朋友都是真爱啊，这篇就不需要在读了。昨天实在不想读的，今天可以看看这个精简版，会有收获的。相信我~

沉淀盒子分离外泌体致命的缺点就在于沉淀的外泌体样品中有大量的杂蛋白甚至还有杂的游离RNA。这些东西都可能在后续的试验中带来假阳性结果。因此reviewer可能会质疑咱们的结果。但是万变不离其宗，reviewer提出的无外乎是以下几个问题：1、你研究的RNA（蛋白）是不是在外泌体里面？2、你发现的外泌体的功能，是不是真的是有外泌体中你关注的那个RNA（蛋白）引起的。3、你发现受体细胞摄取外泌体后有下游基因表达上升了，表达出的RNA（蛋白）是受体细胞表达的还是外泌体携带来的？

下面hzangs用王红阳、王林辉老师发表在cancer cell 的paper举个栗子

。原文：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistancein Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA

Reviewer扔来炸弹！No.1

reviewer问：“你怎么知道你的lncRNA是在外泌体里面，而不是你分离外泌体的时候将游离的lncRNA一起分离到了外泌体溶液中？”

这样做！

简单有力！ 用RNase单独处理外泌体样品，发现与对照相比lncRNA在样品中的丰度不变；但如何将破膜剂与RNase同时使用，lncRNA在样品里的丰度明显低于了对照。这足以说明，这个lncRNA是被膜包被的，样品里有完整膜结构的只能是外泌体（Evs等忽略这个细节）！如果是目标分子是蛋白怎么办呢？一样的，把RNase换成proteinase，把qPCR实验换成WB即可。

Reviewer扔来炸弹！No.2

如果reviewer又问了:“你怎么知道是你外泌体中的RNA起作用而不是外泌体样品中作为杂质的游离RNA发挥作用的？”

这样做！！

拿不同来源的外泌体处理非耐药细胞，看细胞耐药能力（786-O是母细胞系、7Su3rd是从前者利用药物筛选得到的抗药细胞系，suni是一个化疗药的名称）。本来7Su3rd的外泌体是可以赋予非耐药细胞耐药能力的（图中紫色线），但是利用siRNA敲低7Su3rd中lncRNA后拿到的外泌体不再具有这一能力（图中橘黄色线）。因为前文已经证明lncRNA在囊泡里，这样就完美回答了reviewer的疑问。Ps:曾经论坛里的惜名大神还为我们提供了另一个思路，即使用RNase和proteinase处理掉外泌体样本中的杂RNA和杂蛋白，然后再拿这个外泌体实验，拿到与之前一样的结果，也可以说明起作用的分子在外泌体里面。

Reviewer扔来炸弹！No.3

如果reviewer再问了：“你怎么知道是你外泌体里的特定RNA传递到了受体细胞，而不是外泌体刺激受体细胞表达了特定的RNA？”

这样的问题有点丧心病狂！一般reviewer也不会这么丧心病狂，所以hzangs也就不再贴文章了，之前见到过paper里有类似的验证，hzangs在这里举例说明。假设我们研究的是RNA-a ，这种问题可以通过两种方法证明：1、直接在受体细胞中利用CRISPR-cas9敲除a基因，再利用外泌体刺激受体细胞，之后检测受体细胞中RNA-a的水平，如果在受体细胞中检测到了RNA-a，即可证明RNA-a来源于外泌体，而不是受体细胞自身表达的。2、利用点突变技术构建一个携带特定点突变的RNA-a基因，在外泌体供体细胞中过表达，然后收取外泌体，刺激受体细胞，再在受体细胞中检测发现携带特定点突变的RNA-a，而WT型的RNA-a水平没有明显变化。即可说明问题。

hzangs建立了qq实名交流群，感兴趣的来哦~