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解读生信之美，探索每篇文章的逻辑~大家好我是风间琉璃，前面我们用了好几期的内容从m6A-Seq的差异分析开始，到注释、功能富集、基因组分布可视化、motif分析等步骤，接下来我们就运用我们前面所学习到的知识来解读一篇比较经典的高分文章。文章“N6-methyladenosine dynamics in neurodevelopment and aging, and its potential role in Alzheimer’s disease”于2021年发表于《Genome Biology》杂志上。
2020年最新影响因子为13.583。为了让大家更快速的了解文章所呈现的内容，我们就按照文章结果（Figure）的顺序进行分享。
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〇、期刊信息
一、研究背景
在大脑组织中的m6A修饰能够多方面作用于RNA代谢，包括mRNA稳定性、mRNA翻译等等。并且在年龄相关性神经退行性疾病——阿兹海默症中可能扮演非常重要的作用。本篇文章中，作者使用二代测序、生信以及基因工具等多个技术手段研究发现RNA m6A甲基化通过3’UTR调控与老化过程相关的mRNA转录本的表达水平，同时通过调控阿兹海默症（AD）相关转录本的蛋白水平在AD发生中扮演重要作用。
二、小鼠脑组织模型中神经发育以及老化过程m6A动态变化图谱
作者通过五个不同的时间节点（2周、4周、6周、26周以及52周）以及4个不同脑组织部位（大脑皮层、小脑、下丘脑和海马体）进行m6A-Seq和RNA-Seq。通过peak鉴定后发现peak主要分布在编码区以及终止密码子/3’UTR附近（Figure 1a），作者进一步分析了m6A在不同时间节点的变化情况，发现早期m6A peak逐渐减少，到了26周以后，peak逐渐增多（Figure 1b）。
作者进一步进行motif分析，发现m6A位点主要富集在GGAC这一m6Amotif上（Figure 1c）。
三、神经发育过程中m6A甲基化的时间动态变化
作者进一步聚焦在第2周和第6周的小鼠模型中，通过不同部位的m6A-Seq进行差异分析发现第6周低m6A甲基化的转录本通常具有显著低的mRNA表达水平。而相反地，高m6A甲基化的转录本通常具有较高的表达水平（Figure 1d）。这种图形在后面还出现很多次，都是用于展示m6A甲基化水平变化和对应转录水平变化关联的累计频数图（Cumulative frequency plot）。最后作者对高价计划的转录本进行功能富集分析（Figure 1e）。
四、神经发育过程中m6A甲基化的空间动态变化
作者进一步分析第2周到第6周四个不同部位的m6A甲基化差异分析，筛选具有组织特异性的甲基化位点。发现除了大脑皮层外，其余三个部位在第2周和第6周均具有组织特异性的差异甲基化位点（Figure 2a）。并对对应甲基化位点的基因进行功能注释（Figure 2b）。
五、脑组织老化过程中m6A甲基化的动态变化
作者通过比较分析第6周和第52周的小鼠大脑皮层m6A表达谱，以及青年人以及老年人的脑组织m6A表达谱。作者发现不论是小鼠或者人体中，m6A peak的数量都是增加的，并且发现大部分m6A甲基化位点在人和鼠中具有高度保守型。并进一步将人和鼠的差异基因进行取交集（Figure 3a）。同样作者对这些差异甲基化位点进行功能富集分析（Figure 3b）。
六、脑组织老化过程中m6A甲基化和差异UTR作用
由于m6A位点在3’UTR中富集，而最近研究表明m6A在3’UTR可能发挥聚腺苷酸化作用从而调控细胞老化，并且通常来说更长的3’UTR与更低的基因表达相关。基于此，作者分析发现52周的小鼠具有更长的UTR（Figure 4a），并且作者进一步分析了m6A位点位于哪一种UTR区域，发现40%的差异甲基化m6A位点位于更近的UTR区域，并且对应的基因表达明显下调（Figure 4b-c）。接下来作者进一步使用累积频数图展示不同UTR部位的甲基化其对应转录水平的变化（Figure 4d）。并进行功能富集分析（Figure 4e）。
作者这样一步步揭示了m6A在老化进程中的作用后，作者接下来进一步探索m6A在神经退行性变疾病——阿兹海默症中的作用。
七、阿兹海默症中m6A甲基化调控蛋白水平改变
因此作者对家族性阿兹海默症小鼠和对应年龄的正常小鼠进行m6A差异分析（Figure 5a）。并进一步用LC-MS/MS验证m6A位点数在正常组中比疾病组多（Figure 5b）。并且在RNA-Seq和蛋白组血数据分析提示在疾病组中FTO明显增加、METTL3明显减少。接下来作者发现在疾病组中有120个转录本有更低的3’UTR上m6A甲基化水平（Figure 5c）。并通过GO分析提示这些差异甲基化基因确实可能与阿兹海默症相关（Figure 5d）。
接下来为了进一步m6A对这些转录本的作用，作者首先做了正常组vs.疾病组的转录组差异分析，发现并没有差异（Figure 5e）。所以作者合理推断m6A是作用于蛋白水平，通过质谱分析发现差异的m6A甲基化转录本具有更低的蛋白水平（Figure 5f）。并且通过RT-PCR以及WB进一步验证差异m6A转录本的mRNA以及蛋白水平的差异（Figure 5g-h）。
八、阿兹海默症中m6A调控Tau蛋白的神经毒性通路
这里作者使用果蝇转基因阿兹海默症模型进行功能性验证，并通过RNAi技术分别构建METTL3 (m 6 A writers)、METTL14 (m 6 A writers)、YTHDF (m 6 A reader)果蝇模型，发现敲除m6A调控相关基因后，果蝇眼部表型有所提升（Figure 6a）。接下来作者通过果蝇的攀爬行为分析发现m6A调控相关基因敲除组具有更长的攀爬时间（Figure 6b）。提示m6A确实在阿兹海默症疾病发展中扮演重要作用。
好啦本次的文章解读就到这里啦。
我们来复盘一下，作者首先根据小鼠模型不同时间点以及不同部位揭示了神经发育以及老化过程中m6A的变化图谱，以及m6A位点在不同长度或者部位UTR对转录水平的影响。
接下来作者通过小鼠和果蝇动物模型分析m6A在阿兹海默症中的变化图谱以及其对蛋白表达水平的调控作用。从多时间点多部位的m6A-Seq、阿兹海默症小鼠模型、转基因阿兹海默症果蝇模型等等，展示了作者雄厚的基金支持。
分析手段同样丰富，包括少见的积累频数图展示m6A甲基化水平和转录水平差异、不同长度UTR的m6A甲基化对转录水平的影响。