SDS-PAGE电泳实验原理及步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。 基本原理 SDS-PAGE是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,从而消除了蛋白质分子之间电荷差异。 实验步骤 (1)将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。放入100℃加热5-10min，离心取上清点样。 (2)将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。 (3)组装好玻璃板：固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。 (4)按表格1，根据要检测的蛋白的分子大小，选择相应的分离胶浓度，按表格2的配方进行配制。配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。 (5)向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 (6)按表格3配制浓缩胶。 (7)将分离胶上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。注意，样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。 (8)装好电泳系统，加入电极缓冲液，将样品梳拔去，上样。上样前请确保锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。另外，上样过程中注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。 为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。 (9)稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr. 最后，小心的将胶剥离玻璃板，进行下一步实验。