文献科普 新鲜出炉的时序转录组文章，研究思路是亮点(1)
文献科普 | 新鲜出炉的时序转录组文章，研究思路是亮点
随着测序成本的持续降低，现在做转录组测序价格也越来越便宜，但相对来说发表文章就比较不容易了。今天给大家分享一篇以时序（Time course）转录组学研究发表的小论文，也许能给想要通过转录组研究快速出成果的老师一些可以借鉴的实验设计和数据解读思路，快一起来看看吧。
标题：Transcriptome analysis reveals Vernalization is independent of cold acclimation in Arabidopsis转录组分析显示拟南芥的春化与冷驯化反应无关
时间：2021-06-21
单位：南京农业大学园艺学院
期刊：BMC Genomics
影响因子：IF 3.969/Q2
平台： RNA-seq
样本：拟南芥
研究背景
春化是植物在长期低温暴露后实现开花的过程，冷驯化使植物能够迅速适应寒冷的温度。通过春化，植物通过感知长时间的低温暴露（持续暴露在 2-5°C状态下）来实现开花能力，在这个过程中，植物会启动防御反应（冷驯化）来抵御寒冷。但是，植物春化和冷驯化反应的关系仍存在争议。因此，本研究对经过6周低温暴露后的拟南芥进行转录组测序和生信分析，以揭示春化和冷驯化之间的关系。
研究思路
（1） 对低温暴露42天的拟南芥FRI-Col突变株进行转录组分析，设置8个采样时间点研究拟南芥春化过程的动态转录组结果。
（2） 转录组个性化分析拟南芥春化与冷驯化的关系。
（3） 对拟南芥的春化和冷驯化反应进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）
（4） 揭示植物长期低温暴露所涉及的响应机制——可变剪接
研究结果：
1. 拟南芥春化的动态转录组结果
研究人员采用拟南芥FRI-Col突变株（具有功能性FRI等位基因的Col-0突变），对低温暴露6周的拟南芥进行转录组分析，在春化过程中设置了8个采样时间点（图1A），得到了在不同阶段的动态转录图谱结果，包括样本表达谱相关性热图（图1B）、相邻阶段差异表达基因 (DEG)统计（图1C）、各比较组中共有和独特差异基因的韦恩图（图1D），结果表明短期冷驯化的转录反应更动态，而长期冷驯化的基因表达反应更稳定（图1D）。
图1
对来自不同时间点的所有基因动态表达模式进行分析，这些表达模式表明了短期和长期对低温反应之间的主要差异和联系（图2）。
图2
2.转录组个性化分析拟南芥春化与冷驯化的关系
为了研究春化和冷驯化之间的关系，研究人员重点分析了与春化和冷训化相关通路的基因，
如参与冷训化反应的关键基因CBF1、参与春化作用的关键基因FLC、春化过程中中第一个被激活的基因VIN3等（图3A）。箱线图显示，参与冷训化和春化两种通路的基因表达模式在其变化的时间点方面是不同的，使用qPCR分析也证实了这一研究结果（图3B,C,D）。此外，研究人员研究了冷驯化和春化之间的串扰基因HOS1，这两个通路基因表达呈现相反的趋势，表明这种交互活动不会影响两条通路的启动时间。
以上结果表明，从冷驯化和春化相关通路的重叠调控基因变化角度来看，冷驯化和春化是相对独立的。
图3
3. 冷驯化和春化反应的加权基因共表达网络分析（WGCNA）
接下来，研究人员利用WGCNA分析进一步研究冷驯化和春化之间的关系，该分析得到了28个共表达基因模块（图4A,B）。ERF、LTI 和 SCC涉及的三个网络被确定为冷驯化的关键模块，共参与冷驯化反应的三种反应：一是ERF，参与瞬时反应，与乙烯信号、茉莉酸 (JA) 响应因子、锌指转录因子（ZFP）相关（图4C）；二是LTI，参与28-30d温度变化敏感的快速持久反应，与冷驯化途径（生长素）有关（图4D）；三是SCC，参与14d、28d、42d长期冷驯化反应（图4E），这与底物泛素化和染色质修饰有关（图4 F,G,H）。而春化作用的核心基因VIN3和FLC不参与WGCNA的任何模块，表明冷驯化与春化无关。
图4
4. 春化过程中的可变剪接事件
最后，研究人员研究了春化过程中相关的可变剪接事件，共鉴定出 1540 个差异可变剪接 (DAS) 基因，占所有差异表达基因（DEG）的4.85%。总体而言，低温暴露期间内含子保留（RIs）比例下降，而外显子互斥（MXEs）在1d后出现, 3’可变剪接位点（A3SS）比例也显著增加（图5A）。这些结果表明植物可以通过改变转录本的剪接模式以应对低温环境。
将参与春化过程中相关的可变剪接调节的基因分为三种类型（图5B）：
① 不同的转录物的比例发生变化，包括CNGC5，ICE1，EIN4，PHYB，PIF4，RAB8，ATX1，VRN5和VAL2，这类基因可能具有拮抗功能。
② 转录表达水平发生变化：FLM、MAF2、CIPK3、COR27和ATX2，其转录表达明显增加。
③ 所有转录物具有协同作用：CNGC6、COR15A、BES1、PHYA、PIF7和FCA。
因此，可变剪接对温度变化的响应机制非常复杂。
图5
易基因小结
研究目的：
通过转录组测序分析植物春化和冷驯化之间的关系
研究结果：
通过对拟南芥FRI-Col突变株整个春化过程中的转录组学测序分析，研究人员揭示了冷驯化和春化的独立性，并进一步揭示了植物长期低温暴露所涉及的响应机制。植物对长期寒冷的反应往往倾向于调节可变剪接的模式（降低RI的比例），并且可变剪接机制可以调节冷驯化反应的整个过程。植物的温度传感器在非冷冻的寒冷条件下表现出相似的表达模式，可以在转录水平上感知非冷冻的寒冷。
易基因点评：
本研究的主要亮点有3个：
（1）大多数实验室栽植的拟南芥品种在发芽后4周开花，4～6周后采集种子，难以模拟6周的春化过程。而选用拟南芥FRI-Col突变株，可以延后花期，让整个研究过程得到优质的动态转录图谱结果。
（2）选择了非常详尽的8个采样时间点，可以观察到植物整个春花过程的动态基因变化。（3）不仅仅揭示了植物冷驯化和春化的相互独立性，更进一步揭示了植物长期低温暴露所涉及的响应机制——可变剪接。
从总体上看，与动物研究相比，到目前为止，植物上仅有少量基因的可变剪接功能比较清楚，绝大多数功能并不完全了解。随着转录组测序的不断发展，从转录组数据中会鉴定出越来越多不同的转录剪接体，或许在今后植物的转录组学方向上可以考虑进一步研究可变剪接转录本的具体功能。
文献来源：doi.org/10.1186/s12864-021-07763-3