产品|014期-IVD产品经理必读的1/2/3代PCR技术
Mullis在发明PCR技术后曾这样描述：“用一个单分子DNA，PCR能在一个下午内产生100百万个相似的分子。只需要一个管子、一些简单的试剂和一个用来加热的设备”。
从PCR技术发明至今已过30年，而PCR技术刚好发展到第三代，在过去的30年里PCR技术为生命科学的发展做出了不可磨灭的贡献。
通常我们说的第一代PCR技术就是最初的PCR，采用普通PCR扩增仪来对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，只能做定性分析。
能将微量的 DNA 大幅增加。因此对化石中的古生物残骸，犯罪现场的毛发、皮肤碎屑或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。
PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制。
1. 最初的PCR技术所采用的核酸染料，会对实验人员和环境造成伤害
2. PCR完成之后需要开盖检测，容易发生污染造成假阳性结果
3. 检测耗时长，操作麻烦，容易出错
4. 只能做定性检测
第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR），也叫做qPCR, 荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。通过荧光曲线来判断结果，并可以借助Cq值和标准曲线来定量。
用于传染性疾病病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病诊断
1. 污染风险低
2. 操作流程更简单、经济高效
3. 需要的DNA和RNA加样量少
1. 不同厂家生产的试剂和设备所产生的Cq值之间存在一定的差异，并不具备可比性
2. 存在背景值的影响，结果易产生偏差
3. 对于低拷贝的DNA往往难以检测
4. 当反应体系中有PCR抑制物存在时，常规的PCR体系经常会受到影响。
第三代PCR技术叫做数字PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR）,这是目前全新的一种PCR检测方式，能对核酸进行检测和定量，采用直接计数目标分子而不依赖任何校准物或者外表，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。
用于大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞。通过稀释样品DNA到对应的检测孔中，经过PCR扩增之后，向每个孔里加入特异性荧光探针与产物杂交，然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。
主要应用于突变分析、等位基因缺失、混杂DNA的癌症检测等等。
1.灵敏度更高
数字PCR将传统的PCR反应分割成了数万个体系，这些体系独立扩增，独立检测，保证了个位数的模板数量都可以被检测到。
2.定量更准确
数字PCR通过微体系的荧光计数，直接将反应初始模板数量统计出来，即使某些微滴中的模板数量不止一个，也可以通过泊松分布进行计算。
3.抗干扰能力更强
数字PCR第一步反应体系的分配过程中，会将模板和抑制物分配到不同的体系，降低抑制物的干扰。并且，与qPCR不同的是，dPCR检测的是终点荧光，即使微体系稍微受到了影响，也不会影响最终结果的判读。
1.模板质量要求较高
由于数字PCR将反应拆分成了数万个独立体系，因此其对模板量有比较高的要求，模板量超过微体系量会导致无法定量，过少会导致信号过低，降低定量准确度。
2.非特异性产物的判断
数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光，无论PCR产物是否是特异性产物，只要荧光信号足够强，也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求极高。