单细胞RNA-seq的设计和方法(一)

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单细胞RNA-seq分析介绍

Bulk vs scRNA-seq

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Bulk RNA-seq : 它测定的是一个大的细胞群体中的每一个基因的平均表达水平。对比较转录组学、找疾病标志物、同质系统等研究非常有帮助。

scRNA-seq ：它测定的是细胞分群中每个基因的表达量分布。对细胞异质性、细胞亚群细化、稀有细胞类型鉴定、细胞种群动态等研究很有帮助。

在转录覆盖率方面，转录组RNA-seq依然是金标准，根据测序深度，一般可以观察到80-95%的转录本。而scRNA-seq方法，每个细胞，一般能测到200-10000个转录本，即可以观察到10-50%的转录本，而且每个细胞中很多转录本的计数为零。

一张图展示 bulk vs scRNAseq 的区别

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单细胞RNA-seq的常见应用

常见应用.png

肿瘤、组织、器官的异质性研究

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构建发育谱系


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随机基因表达

比如以下这些情况的研究：

  • 基因的表达是异质和“突发”

  • 基因在“开启”和“关闭”启动子状态之间波动

  • 一个基因的随机表达可以在下游基因中产生更多的随机性

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同时有一个问题需要注意的是，如果较低的mRNA捕获率，则会使scRNA-seq难以得出关于单细胞水平表达的明确结论，所以细胞数量和测序深度对于了解罕见基因表达表型至关重要。那么是不是细胞越多，测序越深越好呢？当然并不是这样，凡事有度。

  • 一般所需细胞数量随样品复杂性而增加

  • 随着生物学中涉及的基因数量减少，覆盖范围要求也随之增加（更多的reads）

  • 混合群体的细胞类型分类，通常需要较低的读取深度，并且可以按每个细胞10000-50000个reads进行测序

我们需要采样多少个细胞，以便我们至少看到每种类型的n个细胞？可以参考下面这个网站的模型 https://satijalab.org/howmanycells

在默认示例中，我们假设有10种稀有细胞类型，每种类型仅占总群体的2％。如果要让我们的样本中至少有5种细胞具有95％的置信度，那么我们总共需要对至少619个细胞进行采样。

单细胞RNA-seq测序平台概述

单细胞方法的比较

Single Cell Methods.png

Full Length Transcripts：SMART-seq(v3)

SMART-seq.png

  • 将感兴趣的细胞分类到单孔中

  • 唯一提供完整转录信息的单细胞方法

  • 目前是低细胞样品的最佳选择（100's-1000's）

Seq-Well:  Honeycomb Biotechnologies

Seq-Well.png

  • 可将高达1ml的样品上样到纳米孔中（100’s –1,000’s of cells）

  • 样品通过重力沉降进入孔中

  • 使用Drop-seq STAMP微珠进行标识编码

  • 不需要复杂的设备或训练，几乎可以在任何环境下采集样品

  • 稳定温和的过程甚至可以捕获最脆弱的细胞

Droplet scRNA-seq

Droplet.png

  • 液滴法可提供单细胞信息，但需要大量细胞才能获得最佳结果（>10000 cells）

  • 根据所使用的平台可捕获50-80%的输入细胞

  • 3’端偏好性

  • 不能用标准方法查看剪接/异构体

inDrops 方法概述

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  • 以约80000 cells/ml 密度注入单细胞悬液

  • 将微珠注入的速度与液滴产生的速度相匹配，可以设置几乎每个液滴都将被装载的条件

    inDrops-2.png

  • Lysis and reverse transcription occurs in the beads

  • Samples are frozen after RT as RNA:DNA hybrid in gel

  • Library prep is based on CEL-seq method (for now!)

  • Moving to template-switching (SMART-seq) style library prep

inDrops文库结构

10x Genomics方法概述

  • Lysis and reverse transcription occurs in the beads

  • Samples are frozen after RT as RNA:DNA hybrid in gel

  • Library prep is similar to SMART-seq method

  • GEM = Gel Beads-in-emulsion
    10x Genomics 文库结构

inDrops vs 10x Genomics

inDrops 

inDrops.png

  • 价格低于10x

  • 样品的成本取决于准备的细胞和文库数量

  • 备份样品费用低

  • 一个6000个细胞的样本运行一次约20分钟

  • 能够观察相当于10x的1/2的基因/细胞（旧文库制备方法）

  • 可定制

10x Genomics

10x Genomics.png

  • 价格更高

  • 样品成本是每个样品的成本，细胞数不是成本的一部分

  • 备份样品需支付全部样品费用

  • 10分钟内最多可并行运行8个样本

  • 可观察2倍于inDrops的基因/细胞

  • 开箱即用

注：以上内容来自哈佛大学生物信息中心（HBC）的教学团队的生物信息学培训课程。原文链接：https://hbctraining.github.io/scRNA-seq/schedule/

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