金立成：原创娃娃鱼微藻生态因子与培养方法

娃娃鱼微藻生态因子与培养方法第一节微藻在大鲵繁殖重要地位微藻在大鲵繁殖与养殖中占有重要地位，它不仅是娃娃鱼优良天然饵料，亦是娃娃鱼性腺发育成熟的物质基础。娃娃鱼生长发育取决于藻相营养成分，特别是一些特殊营养成分如氨基酸、脂肪酸、维生素及矿物质的含量则显得更为重要。娃娃鱼产卵量与质量，娃娃鱼精液质量取决于藻相中必需氨基酸和多不饱和脂肪酸筹。当亲体饵料中富含ω- 3 高度不饱和脂肪酸(尤其是EPA 和D HA) 的　藻相时,娃娃产卵量和孵化率都显著地提高( P < 0. 01) ,表明了饵料中适量的EPA 和D HA 是亲体正常繁殖所必需,娃娃鱼属只有有限的能力对18 碳脂肪酸进行链增长和增不饱和度而成为EPA 和D HA, 因而如饵料中只含18 碳多不饱和脂肪酸而无EPA 和D HA 是不能满足亲体正常繁殖的需要的,一些研究表明,D HA 对鱼卵的孵化有促进作用,Shimma 等[ 1977 ]发现了当鲤鱼卵中D HA 的含量少于10 %时,卵的孵化率很低。娃娃鱼饵料中若不含EPA 和D HA ,亲体即不产卵,高度不饱和脂肪酸是娃娃鱼属卵黄产生所必需的。娃娃鱼亲体的产卵量与卵中的EPA 含量有相关性, 而卵中的D HA含量与卵的孵化率有相关性, 这说明EPA 在与亲体产卵有关的卵巢发育过程中起重要的作用,而D HA 在胚胎的发生发育中起某种特别的作用,而与卵孵化率有关。它们起诱导细胞分化的作用,这两种磷脂酰胆碱分子分别包含了16∶0 加22∶6ω3 和18∶1ω9 加22∶6ω3 ,这些学者提出含有D HA的脂肪或D HA 本身在细胞分化和胚胎发育过程中起一种重要的作用。中枢神经系统的产生和发育是所有动物胚胎发育的一个重要组成部分,一些研究表明,ω- 3 高度不饱和脂肪酸,特别是D HA 在鱼类胚胎发生过程中,对脑和神经的发育至关重要[Moure nte 和Toche r 1992 ;Toche r 等1992 ] ,哺乳类动物也同样[Neuringe r 等1986 ; Ka nazawa 等1991 ] ,ω- 3 高度不饱和脂肪酸也是甲壳类的胚胎发育过程中的重要因素, D HA 在胚胎发育过程中的这两方面的作用有助于解释卵中D HA 含量与孵化率之间的相关关系。娃娃鱼亲体的产卵,卵质和饵料中的脂肪酸种类密切相关,若在饵料中只含有18 碳ω- 3 和ω- 6 多不饱和脂肪酸,饲喂的亲体不能维持正常的卵巢发育和产卵量,也不能保证卵胚胎的正常发育和正常的卵孵化率。娃娃鱼的18 碳ω - 3 不饱和脂肪酸转化成20 碳至22 碳高度不饱和脂肪酸的能力非常有限,因此亲体饵料中必需含有适量的长链高度不饱和脂肪酸,特别是EPA 和D HA 。娃娃鱼在性腺发育前积累的大量脂类，除了为生殖等活动提供代谢能外，还是雌性生殖细胞发育过程中必需储存的重要能源和结构物质，其中必需脂肪酸(EFA)是磷脂和固醇类(生物膜主要结构成分)生物合成中的重要结构组分或转运因子，它对胚胎发育进程及早期仔鱼的存活至关重要¨ 。繁殖期间若缺乏EFA，会影响亲鱼的产卵数以及卵的发育质量，导致鱼卵孵化率下降。对于雌性亲鱼，来自藻相中的的天然脂类、体内储存的脂肪以及重新合成的脂类，通过卵黄蛋白原(vitellogenin，富含极性脂)和其它脂蛋白(富含非极性脂，主要是TAG) 转移到卵母细胞中，因此通过卵黄蛋白原或卵黄蛋白的含量变化可以了解娃娃鱼性腺的成熟度及其变化情况 。娃娃鱼是卵脂储存在脂蛋白中。脂蛋白脂主要是极性脂，特别是卵磷脂(Pc)和磷脂酰乙醇胺(PE)以及以二十二碳六烯酸(22：6n一3，DHA)为主的n一3系列高不饱和脂肪酸(n一3HUFA)；油球由甘油三酯(TAG)、蜡酯(wax ester)等中性脂组成，并含单不饱和脂肪酸(MUFA) 。蜡脂的形成，可能为从氨基酸和葡萄糖前体快速转化成脂类的一种生化机制 ，它的作用是运输和储存分子(尤其当碳骨架受限制时)、提高浮性(蜡脂的比重小于甘油三酯)以及调控通透性和作为能量储存 。娃娃鱼的研究结果显示：脂类组成的季节变化与性腺的成熟 ，和其卵黄的脂类组成、积累和利用有关 。贮存在鱼卵和仔鱼中供能用的脂的质和量，以及高不饱和脂肪酸的含量，都与产卵前的性成熟过程中的营养摄入有关，并直接来自亲鱼在性腺发生过程中储存的脂类¨ 。第二节微藻生态因子1 、温度温度是影响微藻脂肪含量和脂肪酸种类的重要因子之一(Ackman et a1．1968；Thompson et a1．1992a、b)。早期研究表明，在极端高温或低温条件下，微藻合成脂肪的量减少(Aaronson 1973；Opute 1974)。Opute(1974)认为存在脂肪合成的最适温度，且因种而异。他指出极端温度下合成受限可能是相关的酶发生不可逆损伤所致。在水环境中，温度一个极为重要的生态因子。生物的生长需要有一定的温度范围，在这一温度范围内，生物才能进行其正常的生长繁殖等生命活动，称为适温范围。在适温范围内，又可分为最适温度范围、最低适应温度（低限）和最高适应范围温度（高限）。最适温度范围是指生物生长繁殖最快、生命活动最理想的温度范围。若温度超出最低适温和最高适温，生物的生命活动就要受到影响。微藻生长的最适温度范围也不是一成不变的，可随着光照强度和某些营养物质的浓度而改变。连续培养新月菱形藻发现，当培养液中硝酸盐和磷酸盐浓度相似于天然淡水中的浓度时其生长最适温度低，当它们的浓度高于天然淡水中的浓度时，其最适温度范围较高。当温度变化超出适温范围时，即对生物产生严重的危害作用，甚至死亡。但在高温条件下影响更严重，死亡更快。一些生态学家认为，高温对生物的危害是化学性的，而低温对生物的危害是机械性的。硅藻的适温范围是8--25度，在25度时，能在一天内保持恢复繁殖的能力.2、光照微藻和所有的绿色植物一样，只有在有光照的条件下，才能进行光合作用。光在微藻培养中是影响生长最重要的因子之一。（1）光源微藻培养光源主要是太阳光，其次可利用人工光源。使用人工光源，光照时间和光照强度都容易控制，但成本高，一般只在实验室使用。在生产中，只有阴天下雨阳光不足时，才补充人工光源。常用的人工光源有日光灯、白炽灯、碘钨灯、生物效应灯等。微藻的光合作用以及藻体的生长发育，受到光照强度的影响，微藻在进行光合作用时，对光照强度的适应，有一定的范围。光照强度用照度计测定，其单位是勒克斯（lx），也可用米烛光来表示。1勒克斯=1米烛光表11---1表11--2五种硅藻中各种脂肪酸占总脂肪酸的比例%硅藻种类    舟形MMDL  大菱形藻   舟形藻   舟形藻   双眉藻C14:0         3.35       4.99        5.67     3.02    9.16C15:0         0.52       0.26        0.27      —       —C16:0        52.28      27.34       45.27    29.44    6.88C16:1(n-7)   25.35      45.92       36.20    33.56    38.55C18:0         0.15         —        0.16      —       —C18:1(n-9)    1.44        1.07        0.79     2 .14   2.86C18:2(n-6)    1.63         0.34       1.31     0.931.94硅藻种类      舟形藻M   大菱形藻  舟形藻a   舟形藻n  双眉藻C18:3(n-3)      —       0.61     0.83        —      —C20:1(n-9)      —          —      —          —     —C20:4(n-6)    3.28         0.90    0.47       2.80     0.78C20:5(n-3)   2.48       5.32    2.08      4.01     17.04C22:6(n-3)    0.17       —     0.17        —       —其他脂肪酸成分   9.35     13.27    6.79    24.10     22.79总脂肪酸/% (DW) 6.16      9.21    12.92     4.39      7.99表11---3表11--4绿藻干燥藻体中含有之营养素绿藻100g中的成含量主要营养素热 量395 kcal蛋 白 质68.5 g脂 肪11.8 g灰分8.4 g糖0 g膳食纤维7.5 g其它营养素叶绿素2,480 mg类胡萝卜素347 mg叶黄素 (Lutein)72.6 mgβ -胡萝卜素53 mgCGF含量2.4 (A260/mg)维生素维生素A3,800 μg维生素B12,020 μg维生素B26,620 μg维生素B63,170 μg维生素B1246 μg维生素C42,000 μg维生素D186 μg维生素E5,500 μg维生素K1711 μg烟碱酸34,500 μg叶酸3,300 μg泛酸3,700 μg生物素313 μg矿物质钠106 mg钙441 mg铁216 mg镁337 mg磷2,010 mg钾1,270 mg锰9.26 mg锌2.16 mg（2）适光范围适光范围是指微藻细胞能进行正常生长繁殖的光照强度范围。不同微藻的适光范围不同，在适光范围内，光照强度增加，光合作用速度加快，光合作用或细胞分裂速率达到最大值时的光照强度称为最适光照强度或称饱和光照强度。达到饱和光照强度后，光照强度增加，光合作用反而减弱以至受到抑制。适光范围的低限，是补偿光照强度。在这样光照强度下，微藻呼吸作用消耗的氧气与光合作用放出的氧气恰好相等，此时细胞只能维持基础代谢，不能生长，只有当光照强度高于补偿光照强度时，微藻才能生长，光强度低于补偿光照强度时，不仅不能生长，而且还消耗体内储存物质，使细胞干重下降。水生植物吸收营养元素的一般规律（3）米氏方程——微藻细胞对营养盐的吸收是一个复杂的生物化学酶促反应过程，其反应速度和底物浓度的关系符合一般酶促反应的动力学方程——Michaelis-Monten方程。式中V为酶促反应速度，即底物消失速度或产物生成速度；S为限制性底物的浓度；Vmax为最大反应速度，即[S]足够大时的饱和速度；Km为米氏常数，又称为半饱和常数。（2）半饱和常数的意义半饱和常数值可作为微藻细胞能正常生长所需维持水中有效形式营养盐的临界浓度，也可用于比较不同浮游植物吸收营养盐能力的大小。在光强、水温及其它条件适宜而营养盐含量较低时，Km值越小的浮游植物越容易发展成为优势种；Km值越大的浮游植物会因缺乏营养盐使生长受到限制。而当营养盐过于丰富时，浮游植物群落结构会发生明显变化，可能导致某些有害浮游植物的迅速繁殖。 通过试验，测定不同种类浮游植物对营养盐吸收反应的半饱和常数值具有重要意义。 与 之间具有线性关系.当 ，即可得 值。米氏方程仅符合于正常微藻细胞对营养盐的吸收规律。(3)光强光是单胞藻培养中影响其生长及生化成分变化的最重要的因子之一。小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium f．minutissima)和等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)8701的研究发现，低光下两种藻的脂肪含量多而高光下则相反(石娟等2004)。在对其它饵料微藻的研究中得到了相似的结果(Emdadi el a1．1989)。有实验表明，增加光强能够促进脂肪酸含量的增加，如Chlorella vulgaris和Euglena gracilis中多不饱和脂肪酸16：2(n一6)、16：3(n-6)、16：4(n-3)、18：2(n一6)和18：3(n一3)(Pohl el a1．1979)；Chaetoceros gracilis中的16：2(n一4)、16：3(n一4)(Mortenson ela1．1988)。然而更多的研究显示，生长在高光强下的微藻，其不饱和脂肪酸的比例降低，（4）其它因素的影响光照对进行光合作用细胞的作用是复杂的，在分析光对微藻细胞生长的作用时，必须考虑各种因素之间的综合作用。　首先，受温度的影响十分显着。温度通过对微藻细胞新陈代谢速度的影响，而影响微藻细胞对光照强度的要求。在低温下，新陈代谢缓慢，要求的补偿光照强度较低，造成有害作用的光照强度也较低。例如：在7摄氏度时，光照强度为2000lx，小球藻颜色变淡。　其次，营养盐浓度对其影响也较大。在低光照时，营养盐浓度对生长率无影响。在中光下，则表现出营养盐浓度增加，光合作用加强的趋势，而且高营养盐浓度可使细胞在较强的光照下快速生长。 另外，二氧化碳的供给、酸碱度等环境因子对光照的作用也有重要影响。3、盐度水是一种富含各种盐类的溶液，地球上不同水域的水，含盐量的差别很大。淡水水域的含盐量在0.01-0.5之间，半咸水含盐量为0.5-16.0，淡水水域的含盐量为16.7-47.0，超盐水域的含盐量在47.0以上，大洋水和径流降水较少的海区的盐度一般在35左右。 水中含盐量的表示方法有多种，而“盐度”是最常用的。盐度是每千克淡水中所含溶质的总克数。淡水的盐度、氯度和比重之间有密切关系，可互相换算。 淡水盐度对微藻的影响，主要表现在渗透压和比重两个方面。也有适盐范围、最适盐范围、适盐高限和适盐低限等。以骨条藻为例，其适盐范围为7-50，最适盐度范围为25-30，适盐低限和适盐高限分别为7和50。4、营养盐微藻的营养元素分为大量元素、微量元素和辅助生长物质三部分。微藻生长必须的每一种元素都有一个最低量（低限），如果低于最低限，则对生长繁殖起抑制作用。但当某种营养万分含量过高（超出高限）时，也会对微藻产生毒害作用，影响其生长繁殖，甚至死亡，后者的危害比前者更为严重。需要特别注意的是，微量元素的适量和致毒量之间的幅度很小。5、二氧化碳培养微藻的水环境中，二氧化碳呈现各种形式，即游离态二氧化碳（CO2）、碳酸（HCO-3）、碳酸氢盐（HCO-3）和碳酸盐（CO2-3），各种存在形式在水中可互相转化。微藻在光合作用中，对二氧化碳的吸收，以游离态二氧化碳为主，也可吸收以HCO-3和CO2-3形式存在的二氧化碳。水中二氧化碳不足，会影响光合作用的效率。通常淡水中所有形式二氧化碳的总浓度是充足的，在天然水域中不会限制微藻的光合作用。但在人工培养微藻的情况下，微藻细胞的密度很大，白天光合作用进行频繁，二氧化碳的供应往往不足，成为光合作用的限制因子，影响微藻细胞的生长繁殖。水中二氧化碳的来源，主要来自有机物的分解，在微藻培养中，使用有机肥料对保证二氧化碳的供应有一定的作用。此外在生产性的培养中还可采用以下措施。（1）通入含1%-5%二氧化碳的混合空气，效果好，但要防止过量致毒。（2）通入普通空气（含二氧化碳0.03%），通过微小气泡增加水和空气的接触面，使空气中的二氧化碳溶入培养液中。（3）通过搅拌增加水与空气的接触面，使空气中的二氧化碳溶于培养液中。（4）向培养液中添加碳酸盐。第一种方法效果最好，但成本高设备复杂。目前生产上一般采用第二种方法。6、（酸碱度）各种微藻对酸碱度都有一定的适应范围。如扁藻的适应PH值为5-9.5，最适PH值范围为7.0-8.5。天然淡水中的PH值比较稳定，一般为8.1-8.3。但在人工培养条件下，由于各种营养元素的影响和微藻代谢作用的影响，PH值变化较大，有可能超出其适应范围，影响微藻细胞的生长。最常见的是由于微藻光合作用吸收二氧化碳及利用碳酸盐而造成的PH值上升现象。在微藻培养中，测定、了解PH值的变化，以便其变化超出微藻细胞的适应范围时采取相应的措施，是十分必要的。元素与食物链及生物链。就物理学的基本论述，宇宙里所有生物、植物与眼见的物项，全部都是由元素所组成，当物项被其它元素衍化（如氧化）后，所有的元素还是会回到大自然，最显见的案例：(1).生物死亡后肉身腐败后仅剩毛发与骨头，有的在几年内就会全数消失，有的则经百年后亦全部消灭殆尽，于百年还能存在的一般都是因地壳变动入土离氧成化石或经人为保存如木乃伊。死掉的生物尸体之所以会消失，只要的因素是组成躯体的元素在组织败坏后氧化再度回归大自然，只是这些元素非单位元素它是属复方元素，复方元素的形成与转换与衍化须借助有组织功能的躯体，当躯壳消灭后复方元素也会随组织的回归大自然。有大量复方元素的地方比较容易产生流行性病菌毒，因为病菌毒中的元素成份就是衍生病菌毒的养源。(2).植物死亡后的植物只要不是离氧由地底保存的地表植物体，死亡后也一样不出百年都会腐败与消失，植物体也是由元素组成，因此死亡后的植物体也会因氧化将组织元素回归大自然。在植物成长过程如曾下过药物品，物品亦会将组织树体的元素转为复方元素，长久性生存于复方元素的植物，会改变原本植物的有机值。最明显的案例就是：台湾有人将大陆的当归移植于台湾种植，因地表土质与水质的元素不相同原产地，回台湾后移植的当归还是有收成 但其效果仅原产地的1/10。(3).矿石土壤与石块等也是由元素组成，土壤与矿石因为它不是生物，不像生物与植物可供观察，但所有的矿石还是会因氧而分解与腐朽后，土壤元素亦回归大自然，无论是已成型或未成型的物项都是元素，如地底下的岩浆，地球上至今已发现120种左右的单位元素，这些元素就是组成地球动植物初始的基本要项，也是基本养源，生物衍化与成长全部都是操控在这些元素里，各种元素有它基本的比重与酸碱值，元素里的酸碱是主导该水域长出哪一种水中生物或陆上生物的必要条件. 因此你们能在汉中抓到国宝级娃娃鱼，你不可能在其它水域也取的国宝级娃娃鱼，白人与黑人的分际点不是因为白人住在寒冷地带所以长为白人，而黑人就是长在热带所以便成黑人，之所以有黑白人明显之分，也是来自当地区的土壤与水中元素，之所以会有高低鼻梁之分际也是来自于元素。因此找出产地鱼的初始水质，首重工作就是由酸碱值着手，这是水中生物繁殖不可泯灭的定理，因为只有产地的水里才会有单位元素不是复方元素。简单讲就是未被其它药物品或空气所污染的水质检测出的酸碱值，才是繁殖娃娃鱼的基本水质，因为该水质里没有病菌毒的共同养源，源自水中没有另类的复方元素。7、生物因子微藻的生长繁殖除受环境的理化因子影响外，还必须考虑生物之间相互关系的影响因为在生产性培养中是有细菌存在的，同时要绝对防止其它生物的污染是很困难的，这些污染生物与培养微藻的关系和对培养微藻的影响，应该作为一种环境因子看待，叫做生物因子。 生物因子对微藻的影响有促进生长和抑制生长两个方面。 促进生长的例子：某些微藻（如日本星杆藻、骨条藻等）必须在有细菌存在的条件下才能生长良好，否则，即使加了许多营养物质和添加剂，生长也不好。 危害生长的例子：吞食、寄生和抗生等。微藻在代谢过程中能产生某些物质（称为抗生素）能够抑制另外一种微藻或其它生物的生长繁殖。例如实球藻培养液能抑制小球藻和菱形藻的生长。 一种抗生素对不同生物的抑制效果是不同的，有些种类可能受强烈抑制，而另一些种类又可能影响极弱。此外抗生素浓度越大，抑制能力就越强。所以在微藻培养中，只要培养微藻占优势，就能产生大量的抗生物质，抑制其它可能性污染生物的生长。相反，如果培养微藻生长不好，在培养液中不能占优势，污染生物就有可能大量繁殖，最后把培养微藻压下去，造成培养的失败。第三节微藻培养液的成分一、主要元素微藻培养液中包括的主要营养元素（即大量元素）有氮（N）、磷（P）、铁（Fe)、钾（K）、镁（Mg)、硫（S）、钙（Ca)，硅藻培养液中还有硅（Si)。1、氮（N）氮是生物细胞中蛋白质的主要组成物质，约占蛋白质含量的16%-18%，氮源是否充足对微藻的培养至关重要。常见的氮源有硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素、发酵人尿等，其中以硝酸钠和硝酸钾最常用。不同的微藻对硝酸态氮和铵态氮的吸收利用情况是不同的，需要根据不同的微藻选择合适的氮源。氮元素的用量为5×10-6—80×10-6，常用量为15×10-6—30×10-6 ；换算成硝酸盐的用量约为100×10-6—200×10-6 。2、磷（P）磷在生物体内主要参与蛋白质和磷脂的组成，也是许多酶和维生素的组成元素。此外，无机态磷也存在于植物体内，并对其代谢活动有重要意义。常见的磷肥有：磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠。微藻培养中磷元素的常用量为1×10-6-4×10-6，换算成磷酸二氢钾的用量为10×10-6。3、铁（Fe)铁在植物体内有促进叶绿素合成的作用，也是许多氧化酶的重要组成成分。生产上常用的铁肥是柠檬酸铁铵的。无机铁在培养液中易形成胶体复合物而产生沉淀，不易于保持一定的浓度，因此尽管铁在数量上所需很少，但要满足微藻的需要却很困难。4、钾（K）在生物体内，钾的作用主要不是结构功能，而是代谢功能。常用的钾肥有氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等。自然淡水中钾元素的含量较高（380×106 ），用淡水配制培养液时，一般不需另施钾肥。5、镁（Mg)镁是叶绿素主要组成物质之一，同时又与磷酸结合，对植物的生命过程起调节作用。自然淡水中镁的含量较高（1200毫克/升以上），一般不需另加。如需加则用硫酸镁或氯化镁，可以单独使用一种，也可两种同时使用。6、硫（S）硫是蛋白质的重要组成成分之一，培养液中的硫元素一般可在加入其它元素的硫酸盐类（如硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁等）的同时获得。7、钙（Ca）培养兴高采烈中钙的来源，常加入氯化钙或硝酸钙。硅（Si)微藻的生命活动需要较多的硅，硅藻培养液中常添加硅酸钠来补充对硅的需求，一般用量为10--15×10-6。二、微量元素微藻培养液中常用的微量元素有以下十余种，其用量一般为0.5×10-9—50×10-9。现将其名称及所使用的化合物列入表11-4。表11--4 微藻培养液中常用微量元素及所使用的化合物元素名称使用的化合物硼（B）硼酸（H3BO3），焦性硼酸钠（Na2B4O7锰（Mn)硫酸锰（MnSO4),氯化锰（MnCl2)锌（Zn)硫酸锌（ZnSO4)，氯化锌(ZnCl2)铜（Cu)硫酸铜(CuSO4)，氯化铜(CuCl2)钼(M0)钼华(MoO3)，钼酸铵[(NH4)20·7MoO3]钴(Co)氢化钴(CoCl2)钛(Ti)氯化钛(TiCl2)钨(W)钨酸钠(Na2WO4)铬(Cr)硫酸铬钾[CrK(SO4)2]，铬酸钾(K2Cr4)镍(Ni)硫酸镍(NiSO4)钒V)钒酸钠(NaVO3)，钒酸铵(NH4VO3)镉(Cd)氯化镉(CdCl2)锶(Sr)硫酸锶(SrSO4)使用微量元素时，常加络合剂防止沉淀。由于微藻对微量元素的需和致毒量的差距一般很小，略超过其需要量即可引起毒害，所以，在使用微量元素时，需注意用量大小。9、辅助生长有机物质辅助生长有机物质能促进微藻细胞的生长繁殖，增强微藻细胞对环境的适应能力，微藻培养中常用的辅助生长有机物质有维生素B12、维生素B1（硫胺素）、维生素B2、维生素B6、维生素H（生物素）、柠檬酸、烟酸、对氨安息香酸等。三、土壤抽取液土壤抽取液含有微藻生长需要的微量元素和辅助生长有机物质，在培养液中加入适量的土壤抽取液，一般能取得良好效果。土壤抽取液的制作简单，常用的方法有以下2种。1、土壤抽取液（1）土壤1千克加1升纯水，煮沸60分钟，暗处放置两天后过滤，取滤液600毫升加纯水400毫升使用。2、土壤抽取液（2）土壤1千克加纯水1升，再加入NaOH2-3克，煮沸120分钟，冷却过滤后作用。四、络合物络合物的作用主要是使之与铁等微量金属离子结合形成络离子，以防产生沉淀。络合离子可不断释放金属离子为微藻所吸收利用。最常见的是乙二胺四乙酸（EDTA）或其钠盐（用量约在50×10-6）。第五节常用微藻培养液配方微藻种类不同，培养液的配制方法也不同，即使同一种类，个人的惯用方法也不同。现将硅藻、绿藻常用的培养液配方介绍如下：一、硅微藻培养液1、 硅藻门(1)三角褐指藻 Phaeodactylum tricornutum% D2 `- g, R; e( p【分类】硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属【形态构造】卵形、梭形、三出放射形三种形态的细胞。这三种形态的细胞在不同的培养环境下可以相互转变。在正常的液体培养条件下，常见的是三出放射形细胞和梭形细胞，这两种形态的细胞都无硅质细胞壁。三出发射形态的细胞壁有三个“臂”，臂长皆为6～8微米，细胞两臂端间的垂直距离约为10～18微米。细胞中心部分有一细胞核和1～3片黄褐色的色素体。梭形细胞长约20微米，有两个略钝而弯曲的臂。卵形细胞长8微米，宽3微米，只有一个硅质壳面，无壳环带，和具有双壳面和亮环带的一般硅藻不同。在平板培养基上培养可出现卵形细胞。三出放射形三角褐指藻 梭形三角褐指藻卵形三角褐指藻。【繁殖方式】一般为平行分裂，分裂成为两个形态相同的细胞，因无硅质壳，分裂时细胞不会缩小。; o- `9 ?! k7 e+ k/ o【生态条件】生存盐度为9‰～92‰，最适生长盐度为25‰～32‰。生长适温为5℃～25℃，最适温度为10℃～20℃，超过25℃时停止生长，最终大量死亡。光照强度1000～8000lx，最适光照强度3000～5000lx，切忌阳光直射。pH值在7～10环境下，均能上生长繁殖，最适pH值为7.5～8.5。(2)小新月菱形藻 Nitzschia closterium(f. minutissima)【分类】硅藻门，羽纹纲，双菱形目，菱形藻科，菱形藻属4 {4 F# r9 U【形态构造】小新月菱形藻俗称“小硅藻”，是单细胞浮游硅藻，具硅质细胞壁，细胞臂壳面中央膨大，呈纺锤形，两端渐尖，皆朝同方向弯曲，似月牙形。体长12～23微米，宽2～３微米，细胞中央具一细胞核。色素体2片，位于细胞中央细胞核两侧。4 m  g, j- N7 i& C# q【繁殖方式】主要为纵分裂繁殖。【生态条件】新月菱形藻对盐度的适应范围较广，盐度在18‰～61.5‰之间都能生火，最适盐度25‰～32‰。其生长适温范围为5℃～28℃，最适温度范围15℃～20℃。当水温达到28℃以上，藻细胞则停止生长繁殖，藻体大量下沉、凝聚、结块，最后变白而大量死亡。最适光照强度为3000～8000lx，切忌阳光直射，否则导致细胞色素体损坏，藻体变白死亡。新月菱形藻对pH值的适应范围较广，pH值在7～10环境条件下，均能生长繁殖，pH值最适范围是7.5～8.5。3 v/ S/ a4 k6 Z7 (3)牟氏角毛藻 Chaetoceros muelleri【分类】硅藻门，中心纲，盒形藻纲，角毛藻科，角毛藻属5 F9 @" N$ L【形态构造】牟氏角毛藻细胞小型，多数呈单细胞，有时2～3个组成群体。壳面椭圆形到圆形，中央部略凸出，壳环面呈长方形至四角形。细胞大小为（4.0～4.9）×（5.5 ～8.4）微米（环面观）。角刺细长，圆弧形，末端稍细，约20微米。色素体1个，呈片状，黄褐色。【繁殖方式】无性为二分裂繁殖。当环境不良时可形成休眠包子，此外，也能形成复大胞子。【生态条件】牟氏角毛藻为沿岸半咸水种类，适宜盐度范围为10‰～25‰。本种属于高温种类，适宜温度范围为5℃～30℃，最适温度为25℃～30℃。牟氏角毛藻适应于较高的光照强度，在10000～12000lx范围内是适宜的。最适pH值为8.0～8.9。(4)纤细角毛藻 Chaetoceros gracilis6 @* r- w+ ~8 H; G7 X8 C【分类】硅藻门，中心纲，盒形藻纲，角毛藻科，角毛藻属- f! M1 k" A 【形态构造】迁细角毛藻细胞小型，多呈单细胞，有时呈２～３个细胞组成链状，大小５～７×４微米（角刺长30 ～37微米）。【繁殖方式】一般是无形而分裂繁殖，在不良环境下可形成休眠包子，此外也能进行有性繁殖。2 g0 R% |1 M1 S【生态条件】最适温度为28℃～30℃，最适盐度为15‰～35‰，适宜照度为10000～12000lx。: I0 C$ x, H( ]) l9 E. Dl7  二、  绿藻门1、扁藻 Platymonas spp. =Tetraselmis spp.5 H' B- k/ h; O: P' 【分类】绿藻门、绿藻纲、团藻目、衣藻科、扁藻属【形态构造】常用的有青岛大扁藻和亚心形扁藻。藻体一般扁压，细胞前面观呈广卵形，前端较宽阔，中间有一浅的凹陷，鞭毛4条，由凹处伸出。细胞内有一大型、杯状、绿色的色素体。藻体后端有一蛋白核。蛋白核附近有一红色眼点。青岛大扁藻有出现多眼点的情况。4 J; O( C# Y- t青岛大扁藻体长在16～30微米之间，一般是20～24微米，宽12～15微米，厚7～10微米。亚心形扁藻体长在11～16微米之间，一般是11～14微米，宽7～9微米，厚3.5～5微米。【繁殖方式】无性繁殖，主要是以产生动孢子的方式进行，细胞纵分裂成两个（少数情况下四个）子细胞。当环境不良时（如在老培养液中），能形成休眠孢子，椭圆形，一个或两个。没发现有性生殖。5 T5 【生态条件】扁藻对盐度的适应范围很广，在盐度为8‰～80‰的淡水中均能生长繁殖。最适盐度范围为30‰～40‰。扁藻对温度的适应范围也很广，在7℃～30℃范围内均能生长繁殖，最适温度范围约在20℃～28℃。对低温的适应性强，在我国南方冬天能正常生长繁殖。对高温的适应性则较差，温度上升到31℃以上，生长繁殖就会受到较大的抑制，藻色变黄，在南方夏天培养比较困难。扁藻在光强1000～20000lx范围内均能生长繁殖，最适光强范围约为5000～10000lx。在最适光强下，扁藻表现为趋光性。一般扁藻在pH值为6～9范围内均能生长繁殖，最适pH值为7.5～8.5。2、小球藻 Chlorella spp.【分类】绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，卵孢藻科0 Z2 F6 c6 O) O  \7 【形态构造】小球藻的细胞球形或广椭圆形，大小因种类而有所不同，蛋白核小球藻细胞直径为3～5微米。在人工培养情况下，由于环境条件的差异往往使小球藻细胞缩小或变大。小球藻细胞体内有一个杯状或板状色素体，色素体内一般有一个淀粉核，有的种类淀粉核明显，有的种类则不明显。; `8 s( F, u/ h; e【繁殖方式】小球藻唯一的繁殖方式，是依靠细胞内原生质体分裂而形成似亲孢子，当细胞分裂时，原生质体分裂为2，4，8，……个似亲孢子，等到母细胞破裂，似亲孢子就释放出来。【生态条件】海产的小球藻对盐度的适应范围较广，它们在港湾、河口的半咸水中也能生活。生存温度为10℃～36℃，最适温度为25℃左后。在适温条件下生长的最适光照强度为10000lx。小球藻繁殖的适宜pH值在6～8左右。小球藻在含有机质（特别是氮肥）多的水中生长很繁茂。3、微绿球藻 Nannocholris oculata( x4 z. y& A8 l. V. U9 o【分类】绿藻门，绿藻纲，四胞藻目，胶球藻科【形态构造】细胞球形，直径2～4微米。色素体一个，侧生。细胞壁极薄，幼年细胞看不到，在分裂之前才变明显，此时具有模糊的粒质被膜的样子，分裂进行时，这种被膜扩大，在被膜与细胞间形成空隙。【繁殖方式】二分裂繁殖，分裂方向是和长轴呈直角的。细胞分裂后，自细胞有母细胞的被膜裂开处脱出，但是一个或两个可以保留附着在被膜上，相互连接成为一个松散的亚树枝群。【生态条件】微绿球藻对盐度的适应范围很广，在盐度4‰～36‰的范围内均能正常生长。在10℃～36℃的温度范围内都能较迅速的繁殖，最适温度为25℃～30℃。在适温条件下，最适光照强度为10000lx左右，微绿球藻适宜的pH值为7.5～8.5。微绿球藻在含有机质多，特别是氮肥多、氨盐丰富的水中，生长特别好。( ?7 d) P! o) U1 C. w$ B  三、绿藻培养液（1）硝酸铵 （NH4NO3) 50-100毫克磷酸二氢钾 （KH2PO4） 5毫克柠檬酸铁（FeC6H5O7)或柠檬酸铁铵[Fe(NH4)3(C6H5O7)] 0.1-0.5毫克淡水 1000毫升培养扁藻、小球藻或杜氏藻时，添加10-20毫升海泥抽取液效果更好。（2）、绿藻培养液人尿 3-5 毫升海泥抽取液 20-30毫升淡水 1000毫升适用于扁藻和其它绿藻的生产性培养，效果良好。（3）、生产上用绿藻培养液硝酸钠 （NaNO3) 60克尿素 18克磷酸二氢钾 （KH2PO4） 4克柠檬酸铁 （FeC6H5O7) 0.045克适用于扁藻的生产性培养。（4）.单细胞绿藻(栅列藻)培养液水生4号(NH4)2SO4 0.200gCa(H2PO4)2·H2O+2(CaSO4·H2O) 0.030gMgSO4·7H2O 0.080gNaHCO3 0.100gKCL 0.025gFeCL3(1%) 0.150mL土壤浸出液 0.500mL水 1000mL四、浮游硅藻培养液1、水生硅1(mg/l)硝酸氨 120 硫酸镁 70磷酸氢二钾 40 磷酸二氢钾 80氯化钙 20 氯化钠 10硅酸钠 100 柠檬酸铁 5土壤浸出液 20 硫酸锰 2水 1000mL pH 7.02、水生硅2(mg/l)尿素 150 氯化钾 30过磷酸钙 50 硅酸钙 100硫酸镁 50 碳酸氢钠 3硫酸锰 3 土壤浸出液 4mLEDTA-铁 1mL 水 1000mL水生硅2号是用化肥尿素过磷酸钙为氮磷来源,适于大量培养硅藻时选用,生长适温为20～30℃;光强为2,000～5,000米烛光.3、朱氏10号培养液:适用于培养硅藻,蓝绿藻等.H2O 1000mLCa(NO3)2 0.04 gK2HPO4 0.01 gMgSO4·7H2O 0.025 gNa2CO3 0.02 gNa2SiO3 0.025 gFeCL3 0.008 g使用时按1/2,1/4,1/10稀释使用.4、f/2培养液硝酸钠(NaNo3) 75 mg磷酸二氢钠(NaH2PO4) 4.4 mgf/2微量元素溶液 1mLf/2维生素溶液 1mL淡水 1000mL本配方时应与目前生产上使用的各种伪造的培养,但用于硅藻培养时,应再加50mgNa2SiO3.附I:f/2微量元素溶液配方:硫酸锌(ZnSO4·4H2O) 23mg硫酸铜(CuSO4·5H2O) 10mg氯化锰(MnCl2·4H2O) 178mg柠檬酸铁(FeC6H5O7·5H2O) 3.9g钼酸钠(NaMoO4·5H2O) 7.3mg乙二铵四乙酸钠(Na2EDTA) 4.35g六水氯化钴(CoCl2·6H2O) 12mg纯水 1000mL附II:f/2微量元素溶液配方:维生素B12 0.5mg维生素H(生物素) 0.5mg维生素B1 100mg纯水 1000mL以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。从以上各种配方，可看到配制藻类培养液的几条原则：（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。（4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。第六节、培养液的配制培养液是根据培养液配方配制的，选定配方后，即可配制培养液。保种用的营养盐最好用试剂级，为了减少每次称重的麻烦，可将各种元素分别配成母液，用时吸取一定量即可。具体的浓度根据配方而定，通常在配制培养液时以每升水加入母液1毫升为宜。例如：配方中硝酸钠的用量为0.1克/升，母液每毫升就应含硝酸钠0.1克，配制1000毫升硝酸钠母液就需要加入100克硝酸钠。维生素和微量元素一般也单独配成母液，用时吸取。 生产池的营养盐可用农用化肥料，按配方称取，加消毒水溶化后倒入池中即可。第七节、培养方式现介绍一些主要的微藻培养方式。以培养的目的要求不同.但可分为密闭式培养和开放式培养两大类.1、密闭式培养:密闭式培养的目的是不使外界杂藻,菌类及其它有机体混入培养物中.将培养液密封在与外界完全隔离的透明容器中,由此通气,搅拌,输送培养液及调节水温和取样等设备,也都要与外界隔离.培养容管状,也有池状,用有机玻璃或透明的聚乙烯所料做成水平管道,直立或斜立在地上,暴露阳光或人工光照下.这种培养方式,成本高,好控制,产量亦稳定.2、开放式培养:将微藻培养于敞开的容器(如水泥池,管道,木盆等)中.方法设备较简便,可进行小量或大面积的培养.该法培养物中易发生敌害生物污染,但成本低,使用较普遍,也是今后微藻培养所应采取的方式。第七节 纯培养与单种培养纯培养：是指排除了细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养要求有无菌室、超净工作台等设备条件，容器、工具、培养液等必须严格灭菌。纯培养是科研工作中不可缺少的技术。单种培养：生产性的培养中，是不排除细菌存在的，为了区别于纯培养而称之为单种培养。1、藻种培养、中继培养和生产性培养(1)藻种培养：在室内进行，一般采用一次性培养法。培养容器为100-3000毫升的三角烧瓶，瓶口用消毒的纸或纱布包扎。目的是培养和供应藻种。(2)中继培养：目的在于培养较大量的高密度纯种藻液，供应生产性培养接种使用。生产性培养：可在室内也可在室外，有封闭式培养和开放式培养两种类型。目的是供给育苗中的饵料。培养容器为大型水泥池、大型玻璃钢水槽的塑料大袋；也有用土池培养的情况。2、封闭式培养与开放式培养(1)、封闭式培养：是把培养液密封在透明的容器中，与外界隔离。培养容器多为管状，用有机玻璃或透明的聚乙烯塑料做成管道，水平、直立或斜立于地上，暴露在阳光中（或用日光灯光源），二氧化碳完全采用人工供给的办法，并利用水泵使培养液不断循环。完全封闭式培养所用的设备主要包括培养槽、气体交换塔和控制系统三部分，其优点是容易控制，产量稳定，但设备成本较高。目前国内采用的玻璃柱和塑料袋培养，效果很好。具有方法简单、成本低、培养的藻细胞密度大、不易被污染、生产周期短等优点。（2）开放式培养：是把微藻培养在敞开的容器中。二氧化碳采用人工供给或依靠与空气的自然交换，如常见的广口玻璃缸、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池培养等。开放式培养设备简单，成本低，是目前培养微藻的主要形式。开放式培养由于光照充足，通风较好，藻细胞生长繁殖迅速，但因藻液与外界接触面大，容易受敌害生物污染。3、培养方法微藻培养的一般方法为：容器、工具的洗涤和消毒，培养液的制备，接种，培养管理。4、容器、工具的洗涤和消毒培养用容器、工具的洗涤和消毒是微藻培养中最基本的一项，稍有疏忽就会引起藻种间的混杂和敌害生物的污染，造成整个培养工作失败，因此必须引起足够的重视。所有培养用容器、工具都必须在用前用去污粉、洗液或肥皂粉等刷洗并冲洗干净，如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸钙等物粘附，不易刷洗，可用1%浓度左右的稀盐酸浸泡去除，然后用水冲洗。容器、工具洗刷干净后，用以下几种方法进行消毒。5、加热消毒法加热消毒法是利用高温杀死微生物的方法。不耐高温的容器、工具，如塑料和橡胶制品等不能用此法消毒。（1）直接灼烧消毒：接种环、镊子等金属小工具，试管口，瓶口等可以直接在酒精灯火焰上短暂灼烧消毒。载玻片、小刀等则最好先蘸酒精，然后在酒精灯火焰上点燃，等器具上的酒精烧光，也就完成了消毒操作。直接灼烧消毒可以直接把微生物烧死，灭菌彻底。优点是简单、方便、快速、效果好。但只适用于小型金属或玻璃工具。（2）煮沸消毒：把容器、工具放入锅中，加水煮沸消毒。一般在水中煮沸10-20分钟。对大型锥形瓶消毒时，可在锥形瓶口放一只培养皿，然后在锥形瓶中加少量淡水，加热煮沸完毕即用消毒纸或纱布蒙上备用。煮沸消毒法的作用是杀死全部营养体的部分芽孢。如果在水中加1%碳酸钠效果更好，此法只适用于小型的容器、工具。6、化学药品消毒法在大规模培养微藻的生产中，大型容器、工具及培养池一般用化学药品消毒，常用的消毒药品有漂白粉（或漂白液）、酒精、高锰酸钾等。（1）漂白粉[Ca(ClO)2]或漂白液：漂白粉又称氯石灰，为白色粉末状物质，是氯与氢氧化钙作用的产物。在空气中因受二氧化碳作用，逐渐放出次氯酸而有强烈的刺激性气味。工业上用的漂白烩一般含有效氯为30%-35%，消毒时按万分之一到三的含量配成水溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小时，再用消毒水（经过煮沸或沉淀过滤的水）冲洗三四次即可。白瓷砖池、水泥池的消毒可配成高浓度浆糊状的漂白粉溶液淋洒池壁，半小时后用消毒水冲洗干净；为充分消毒培养池，也可用较低量的漂白粉进行全池浸泡后用消毒水冲洗干净。因漂白粉有氯臭味，还需要停放12小时才能接种使用（一般下午消毒池子，明天早上接种），以免抑制微藻生长。使用漂白粉消毒需长时间浸泡，同时氯臭味较难除去。漂白粉暴露于空气中易分解，遇水或乙醇也分解，应密封储存。也可用漂白精进行消毒，漂白精主要成分是次氯酸钙，一般含有效氯70%左右，用漂白精消毒，用量应减半。漂白液含有一定量的NaClO，是化工厂的副产物，有效氯的含量一般在5%左右。由于漂白液具有价格低廉、无大型杂质、不产生沉淀物及便于储藏和用法简单等优点，被育苗场广泛地用于容器、工具和培养池的消毒。使用时可参照漂白粉的用量进行具体的调整。7、接种培养液配好后，即进行接种培养。接种时应注意以下几点。7.1、藻种质量藻种质量，对培养效果影响很大，一般要求选取生活力强，生长旺盛的藻种。藻种好坏的标准可从以下几个方面考虑：（1）外观：第一看颜色是否正常，正常情况下，绿微藻呈鲜绿色，硅微藻呈黄褐色，金微藻呈金褐色；第二看水中分布情况，有运动能力的种类上浮活泼运动；无运动能力的种类均匀悬浮于水中；第三看附壁和沉淀情况，好的藻种无明显附壁，无大量沉淀。（2）镜检：好的藻种细胞颜色鲜艳，运动种类运动活泼，无杂藻和敌害生物存在。7.2、接种比例选好藻种后，进行细胞计数确定投入量。用量可用以下公式计算：N2V2=N1V1 其中：N1为藻种细胞密度；V1为藻种用量；N2为接种后培养液的藻种密度；V2为接种后培养液的体积。微藻接种一般采用（1：2）-（1：5）的比例，大量生产特别是室外培养应适当提高比例，常采用（1：1）-（1：3）比例接种。另一方面又缩短了培养周期，这是培养成功的重要经验之一。特别是在环境因子不很适合，微藻生长不良，敌害生物有大量出现的可能时，高比例的接种量尤其重要。由于接种比例高，需要的藻种量大，藻种不足时，可以采用分次加培养液的方法。例如：一个20立方米水容量的培养池，如果一次按1：1的高比例接种，需要藻种10立方米，而采取两次加培养液的方法，只要藻种5立方米就可以了。第一次先配培养液5立方米，接种5立方米藻种，总水量为10立方米，为培养池容量的一半。培养两三天后，再加培养液10立方米，再培养三四天达收获密度。这样始终保持了1：1的高比例接种量。另一方面，分次加培养液，对微藻的细胞生长繁殖效果很好。7.3、接种时间接种时间最好选择上午11-下午3点时进行，而不宜在晚上接种。因为晚上不少微藻细胞沉在底部，而白天微藻细胞进行光合作用，有趋光上浮的习性，特别是具有运动能力的种类更明显。早上8-10点一般是微藻细胞吸出做藻种，弃去底部沉淀的微藻细胞（这些微藻细胞的生活力往往较弱），起到选种的作用。第八节培养工艺程序一般生产上采用一次性培养和循环生产法。一次性培养，就是一次性施肥、接种培养，最后达到收获。在生产池中加入消毒淡水和营养盐，接入适量的藻种后，在适宜的条件下，4-5天即可达到最高细胞密度。此时池内的藻液可作为饵料输入育苗池。然后将池子清洗后再进行新的培养。如果以5天为一个培养周期，则可将生产池分为五组，每天接种一组，连续五天将所有生产池接满，然后循环地按次序进行收获。培养程序是：3000毫升三角烧瓶——20升细口玻璃瓶——保种池——生产池——育苗池。接种用量是：一只3000毫升三角烧瓶接种1只20升细口玻璃瓶，三只细口玻璃瓶接种一个1吨级的保种池，一个1吨级的保种池可接种两个5吨级的生产池。一、培养管理微藻培养过程中，管理工作包括日常的管理操作、生长情况的观察和检查、出现问题的分析处理等几个方面。1、日常管理操作（1）搅动和充气：其作用表现在三个方面。第一，增加水和空气的接触面，使空气中更多的二氧化碳溶解到水中，补充由于微藻细胞的光合作用对二氧化碳的消耗；第二，防止水表面产生菌膜；第三，使微藻细胞均匀受光，使微藻细胞均匀分布，帮助沉淀的微藻细胞上浮而获得光照。在培养中可根据具体情况分别采用摇动、搅动和充气的方法。摇动的搅动每天至少进行三次，定时进行，每次半分钟左右。充气一般通入空气，充气时要对空气进行过滤，使气体先通过空气过滤器，然后再通入微藻培养液中。（2）调节光照：光照适合与否，对微藻的生长关系很大。常用的是太阳光和灯光，要根据不同微藻对光照的具体要求来进行调节。但一般地讲，所有的微藻都不能忍受强烈的直射阳光。一般饵料培养室的顶部都用玻璃钢瓦采光，中午自然光比较强时，可用白布进行遮光；自然光较弱时，需增加人工光源。常用的人工光源有日光灯、碘钨灯、生物效应灯等。（3）控温；每一种微藻都有其适应温度范围和最适温度范围。如果能在控制温度的条件下培养，当然是最理想的。在目前还不具备控温条件的情况下，在培养过程中也应该尽可能使温度适合于培养微藻的要求。一般高温对培养微藻生长不利，在夏季室内培养时，须把门窗打开通风降温，必要时需增加换气扇或风扇等设备。如果气温急降，须关闭门窗，防止温差过大。在北方春季、冬季，气温较低，一般室外培养不能进行，在室内需要采取措施提高室温，才能进行正常培养，可采取水暖、气暖等措施。第九节、微藻培养设施及设备目前我国在微藻培养中普遍采用的是开放式通气培养方法。生产上，培养设备包括工作室、培养室、沉淀池、水处理系统、培养容器、淡水消毒池、饵料培养池等。现分别介绍如下：1、工作室在车间的一端，是饵料培养工作人员经常工作的地方，需配有显微镜、解剖镜及其它常用的仪器、工具、药品等。紧靠工作室还需有保种间和清洗消毒间。保种间面积视培养规模而定，一般为10-20平方米，配有空调、冰箱、具有人工光源的培养架等，工作人员在保种间可以进行藻种的分离、培养、保藏等工作。清洗消毒间，面积10-15平方米，室内设有清洗水池、消毒池、高压蒸气灭菌锅、炉灶等，可以供少量淡水及容器、工具消毒用。2、培养室培养室的作用是进行藻种和中继培养和投喂性大规模培养。培养室采用投光率80%左右的玻璃钢瓦覆顶，为进一步增加室内的光照强度，四周墙壁均开设大面积的玻璃窗。为调整光照强度，房顶部设有白布用作天幕，池水面上方1米处安装日光灯、碘钨灯或生物效应灯等人工光源；为防止高温季节培养饵料的高温问题，培养室对向各开设一个大型的换气扇或在培养池上方增设吊扇，进行通风降温；为防止雨期房顶漏雨和严寒季节室内蒸汽在房顶冷凝，可在房顶增设塑料薄膜。室内的主要设施有进行藻种中级培养的玻璃钢桶、小型的贴白瓷瓦的水泥池和大规模培养的大型水泥池。3、沉淀池沉淀池一般建在地面以上，并经常建在较高地势处，兼作高位水池。若沉淀池建在地势较低处，则需要有二级提水设备。沉淀池容量为育苗池总容量的3-4倍左右，沉淀时间在48小时以上为好。沉淀池一般呈长方形或圆形，砖、石砌成，深度不宜过大，内层抹五层防水层。为达黑暗沉淀 ，池顶加盖。池底应有1%-3%的坡度，便于清刷排污。池下部设置排污口和供水口，顶部设有进水口和溢水口。为确保沉淀水的连续使用，沉淀池一般可分为2格以上。4、培养容器在生产中常用的培养容器有下列几种：三角烧瓶：保种用100毫升的三角烧瓶。开始扩种时，培养容器逐步扩大，100毫升→250毫升→500毫升→3000毫升→5000毫升。三角烧瓶主要用于藻种的分离、保藏和藻种培养等小型培养方面。三角烧瓶可以煮沸消毒，也可以在烘箱中消毒。三角烧瓶的优点是瓶口小，不易落入孢子等，不易被污染。玻璃细口瓶：容量为10000或20000毫升，中继培养时用。玻璃钢桶：用环氧树脂加玻璃纤维布做成。中继培养时用。广口玻璃缸：一般商店用来装糖果、食品的玻璃缸，俗称糖果缸，因价格低，购买方便，南方多用来作为中继培养的容器。容量以8000-10000毫升为宜。玻璃质量以无色透明、无气泡为好。塑料薄膜袋：一般用透明薄膜制成，大小不等，中继培养及大量培养时使用。5、水处理系统一个育苗场通常只有一套供水系统，同时提供饵料培养和育苗用水。微藻培养对水的要求比较严格，须经过过滤或化学药品处理，除去或杀死水中的敌害生物。因此必须配备水过滤装置和淡水消毒池。(1)、水过滤装置淡水从溪流中经动力管泵打到沉淀池，沉淀48小时后，经砂滤装置作第一次过滤，把大型的生物和非生物杂质除去，再经陶瓷过滤器过滤，将微小生物除去。常用的水过滤装置有：砂滤缸、砂滤罐、砂滤陶瓷过滤器等。6、饵料培养池其用于大规模生产培养。培养池建在室内或室外，为易于控制培养的环境条件多以室内建造为主。6.1、培养池的结构培养池采用水泥混凝土建造，表面涂以防水胶；池形取长方形；池深70厘米（水深50厘米左右），中池（2-4立方米左右）和大池（5-10立方米左右）。由于大池受光面积大、气体交换量大、单胞藻生长良好及节省占地面积等优点，很多厂家直接建造大池。为保证饵料的安全供应，饵料培养水体应为育苗水体的1/3以上；二者的比例如达1：1则最为理想。7、充气系统7.1、充气机大量培养微藻时各地可根据具体情况选用罗茨鼓风机、空气压缩机或小型充气泵等设备产生气源，风机的匹配功率由水体的大小确定。为确保空气的清洁可以进气孔外增设空气过滤器。7.2、充气管和散气石供气管采用灰塑料硬管，池内充气管多采用塑料软管。散气石采用低标号的炭化硅胶气石（如80号）或末端不加散气石，以防止藻液表层形成过厚的有机物膜。8、藻种的分离微藻的培养，首先需要有藻种，藻种可以向有关的保处单位购买，也可以从天然水域中分离。从天然水域混杂的生物群中，运用一定的方法，把所需要的个体，分离出来，而获得单种培养。目前我国能成功地进行大量生产的藻种不多，远未能满足各种经济大鲵人工育苗的需要，这就需要进行新的藻种的分离和培养。另一方面，若藻种受敌害生物及其它杂藻的污染也要通过分离进行纯化。8.1采样及预备培养(1)、采样分离藻种，首先要采集生长有需要分离的微藻的水样。个体较大的浮游微藻（30微米以上），可用350目的浮游生物网在水中捞取。通过浮游生物网的过滤，可获得较浓的微藻样品。但在海产大鲵的人工育苗中所需要的饵料，一般个体很小（几微料到十几微米），用不着浮游生物网无法采到，所以要把水样采回室内处理。水样可取自天然海区，特别是海边的小水洼，在这些小水洼中，往往生长有适于静水体培养的微藻，且种类比较单纯，一种或几种微藻的数量占优势，容易分离。底栖种类一般从礁石上刮取，还可刮取潮间带的“油泥”，加淡水搅拌后，弃去沉淀 的泥沙，用密筛绢过滤掉大型微藻和杂质，即可获得微藻细胞浓度较高的水样，也可以把附着在大型微藻（如马尾藻等）藻体上或其它附着物上的附着微藻洗刷下来作为分离的水样。(2)、预备培养水样采回后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的微藻，而这种微藻在水样中数量较多时，可立即进行分离。若数量很少，分离困难时，最好先进行预备培养，待其数量增多时，再分离。 预培养的培养液营养盐的浓度应小些，一般只有原配方的1/4-1/2。预备培养的培养液最好能使所需微藻良好生长，而不需要微藻的生长受到限制。可有选择地加入药品。例如：在培养液在加入抗菌素可抑制硅藻生长，用量为1-10毫克/升。抗菌素可选用青霉素或硫酸链霉素。8.2、藻种分离方法，常用的有以下几种：(1)、微吸管分离法原理：　在无菌操作条件下,用极细的微吸管,在显微镜下把目标藻样从一个玻片移到另一个玻片,采用同样的方法反复操作,直到镜检水滴中只有目标单种为止。方法　a、在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管,分离操作时, 用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上,在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞, 放松手指, 藻细胞被吸入微吸管;接着把吸出的水滴放在另一载玻片上, 显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞,经过如此再反复操作, 直至达到单种分离的目的。然后把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内, 放在适宜的光照下培养,试管有藻色后镜检,培养为单种的试管,其他不合格的弃掉。B、取直径5毫米的细玻璃管，在酒精喷灯上加热，待熔时，快速拉成口径极细的微吸管。检查拉好的微吸管是否通气，将其放在盛水的烧杯中，看管是否有段水柱。若拉的不好，可在酒精灯上整理。微吸管拉好后，将稀释适度的藻液水样，置载玻片上，镜检，用微吸管挑选要分离的微藻细胞，仔细地吸出放入另一特制的经消毒的小载玻片（0.5×0.5平方厘米）上，镜检这一滴水中是否是所需要分离的微藻细胞。如分离不成功，须反复同几次，直到达到分离目的，然后将含有所需分离微藻细胞的小载玻片直接移入装有培养液并经过来灭菌的试管或小三角烧瓶中进行培养。 微吸管分离法，操作技术要求高，分离时要细心，往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，此法适宜于分离个体较大的微藻，个体较小的微藻用此法分离较为困难。(2)、水滴分离法原理：　在无菌操作的条件下,把要分离的藻样用微吸管在玻片上滴成大小合适的小水滴,镜检水滴中只有一个要分离的单种,即可冲入试管培养。方法　a、用小烧杯装稀释的藻样, 将微吸管插入藻样中, 提取微吸管, 让多余的藻液滴出,然后把管口与消毒过的载玻片接触, 即有一个小水滴留在载玻片上。一个载玻片滴3～4 滴,间隔一定距离, 然后在显微镜下观察。若一个水滴中只有一个需要分离的藻细胞(无其他生物混杂) , 即用移液管吸取培养液把该水滴冲入试管中, 试管口塞上棉塞, 放在适宜的条件下培养。该分离法的关键是藻样稀释要适宜(稀释至每个水滴约有1～2 藻细胞) , 水滴大小适宜,以在低倍镜下能看到水滴全部或大部分为宜, 并且观察要准确、迅速。B、用微吸管吸取稀释适度的藻液，滴到消毒过的载玻片上，水滴尽可能性小些，要求在显微镜低倍镜视野中能看到水滴的全部或大部分，一载玻片滴2-4滴，水滴作直线排列，互相间隔一定距离。在显微镜下仔细检查每一滴水，如果一滴水中只有一个或几个需要分离的同种微藻细胞，无其它生物混杂，即用吸管吸取培养液把这滴水冲入装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中。如果分离不成功，反复重做，直到达到目的。 水滴分离法，方法简便、易行。尤其适宜于已在培养液中占优势的种类。各繁殖场分离受少量生物污染的微藻多用此法。水滴分离法在操作上要求细致、认真，使用的工具及培养液必须严格消毒。(3)、稀释分离法把含有需要分离的微藻而又混杂有其它生物的水样，取其一定量用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴水含有一个左右生物细胞（可能一个都没有，也可能有两个）在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后把装有1/4容量培养液的试管20支左右，每一试管加入稀释适宜的水样一滴，摇匀，进行培养，待微藻生长繁殖达到一定浓度时，再检查是否达到分离的目的。如果未达到，再重复做，直到成功为止。 稀释分离法，操作简单、易行。但分离培养中有一定程度的盲目性，没有水滴分离法效果好。(4)、平板分离法仅适合于能在固体培养基上生长的种类。（a）平板培养基的制备：该培养基的制备包括调配、融化、分装、灭菌四个步骤。调配：按分离种类的需要选用合适的营养盐配方配成培养液，加1%琼胶（又称冻粉），琼胶剪成细片，加入培养液中浸泡12小时。融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶完全融化。在加热过程中，水分要蒸发不少，在加热完毕应以淡水补充蒸发掉的水分。分装：稍冷后即分装于培养皿中，装的厚度依培养皿大小而定，在0.3-0.5厘米之间。灭菌：固体培养基的灭菌要求严格，一般采用高压蒸气灭菌法灭菌。（b）平板分离方法：经灭菌的固体培养基冷却后，培养基凝固成固体状态，即可进行分离。划线法：把一个金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取需要分离的藻液轻轻地在平板上划折线。喷雾法：将需要分离的藻液稀释，装入经消毒过的小型喷雾器中，打开培养皿盖，把藻液喷射在培养皿表面形成分布均匀的一薄层水珠。用喷雾法或划线法接种后，盖上培养皿盖子，放在适宜的光照条件下培养。培养一段时间后，在培养基上可出现互相隔离的微藻群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的玻璃针从培养基上取出，移植到装有培养液并经过灭菌的容器中培养。培养一段时间后，再进行显微镜检查，若无其它生物混杂，才达到单种培养目的。如果不成功，则应重做。平板分离法2、作为微藻分离用的固体培养基,是在常规的液体培养基中加入一定量的琼脂,并且使其溶解和高温高压灭菌后,通过适当的方法,把要分离的藻样接种在培养基上,通过一定的时间培养,在培养基上长出单个的藻落而达到分离的目的。接种的方法接种在超净工作台上进行,接种的方法有两种。喷雾法：　首先用消毒海水把要分离的藻样进行适当的稀释,装入消毒过的医用喉头喷雾器中,打开培养皿盖,把藻样喷射到培养基平面上,使藻样在培养基表面上形成分散均匀的一层薄水珠。水样稀释到合适的程度是指水样喷射在培养基平面上必须相隔1cm 以上有一个藻细胞,否则将来长出的藻落距离太近,不易分离。划线法：　把接种环在酒精灯上灭菌后,蘸取藻样轻轻在培养基平面上做第一次划线3～4条,把培养皿转动约70°角,并把接种环在酒精灯上灭菌,通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三、第四次划线。由于第一次划线接种环上的藻细胞比较多,在第一划区藻细胞可能密集不能分离开,但通过后面的划线可能分离出单独的藻类群落。(5)、抗菌素分离法该法是对抗菌素敏感的种类被杀死后，而对抗菌素不敏感的种类继续生长繁殖。例如绿藻中污染了蓝藻，可以加抗菌素，抑制蓝藻的生长。在分离藻种时应注意：所有的工具都要消毒；加热消毒的工具必须冷却后使用，不然会杀死藻细胞；分离后刚开始培养的一段时间，应放在弱光下，不要摇动；培养基最好无沉淀，如有沉淀，可用微孔滤膜过滤。9、藻种的培养藻种的培养包括三方面的内容：一是对新分离的藻种的培养，包括用微吸管得到的单个细胞的培养，这类培养是在小型容器（一般为100毫升的三角烧瓶）中进行的；二是保种培养，是为了使藻种得到长期保存，需要时随时取用；三是藻种的扩大培养，目的是为了满足生产上对大量藻种的需要。 藻种培养时，培养容器、工具经煮沸消毒或使用化学药品消毒后，用煮沸淡水冲洗干净，培养液用加热灭菌法消毒，接种后瓶口用消毒纸包扎，放在适宜的光照条件下培养。藻种培养除扩大培养外，一般不充气，只做定时的摇动。藻种在培养过程中必须定期进行显微镜检查，出现污染应及时分离。10、藻种的保藏保种用的固体培养基中营养物质浓度较高（一般为液体培养基的两倍），琼胶用量为1%-1.5%。按平板分离法制备固体培养基，培养基经灭菌冷却后，用喷雾法或划线法接种。接种时要在火焰附近操作，保持无菌状态，或在超净工作台中进行。 常用固体培养基保种方法有两种，一种是把藻种接种在固体培养基上，在弱光条件下培养，使微藻细胞在培养基上慢慢生长繁殖，让培养基的营养逐渐消耗。此法可保存半年到一的年。另一种是低温保藏。最好用试管斜面固体培养基，接种后，首先放在光照充足的地方，常温培养到微藻细胞达到较高密度后，即置冰箱或冷库中，一般在5摄氏度左右的低温下保藏，每天让藻种接受短时间的弱光照（几个小时），此法保种时间可达半年到两三年。例如，用此法，新月菱形藻可保存34个月，三角褐指藻可保存25个月。但如果在完全黑暗的 条件下，则保存时间大大缩短，新月菱形藻只能保存6个月。 固体培养基保种具有占地面积小、保存时间长等优点。但也有其局限性，只能保藏一些适合于在固体培养基上生长的种类。见图11—1。图11—1菌种保藏第九节硅藻的简介：1871 年，Pfitzer 先生首先根据硅藻的色素细胞（chromatophore）的数目、形状等特征将硅藻分成两个目（Order）：Coccochromaticae和 Placochromaticae。之后，在 1896 年时，Schütt 首先将硅藻分类为硅藻科（Family Bacillariaceae），并细分成圆心目（Centricae）和羽状目（Pennatae）两个目，并陆续有其它研究者将硅藻做进一步的分类（Patrick and Reimer, 1966）。本研究主要是采用 Sze（2000）所归纳的分类方式，同时参考 Patrick and Reimer（1966）、Jin et al.（1985）、Round et al.（1990）、Witkowski et al.（2000)等人的所出版的图鉴，来作为硅藻的分类。硅藻属于金藻门（Chromophyta），硅藻纲（Bacillariophyceae）；硅藻纲可依据硅壳的对称性，分为辐射对称（radial symmetry）的圆心目（Centrales syn: Centricae）以及两侧对称（isobilateral symmetry）的羽状目（Pennales syn: Pennatae）。羽状目还可再细分为：无纵沟亚目（Araphidineae）及有纵沟亚目（Raphidineae）。但根据分子定序的分析结果，会长成串状或是链状的圆心目和无纵沟亚目两者是并系群（paraphyletic）的关系（Graham and Wilcox, 2000）。目前已知，全世界的硅藻有 285 属，约 10000～12000 种(Raymont, 1980; Round et al., 1990)。几乎所有的圆心目硅藻都是行真性浮游生活（euplanktonic），而羽状目硅藻大多为底栖性（benthic）生活；此外，另有兼性浮游（meroplanktonic）性硅藻（Sze,2000）。其中尚可细分成附生性微藻（periphytic）、表生性（epizoic）（如螃蟹、鲸鱼的体表）、大鲵体内共生（endozoic），甚至有些硅藻是生活于极地的冰层中或是潮湿的土壤表面（Graham and Wilcox,2000），也就是所谓的陆生型硅藻（terrestrial diatoms）。硅藻的细胞壁称为硅壳（frustule），由硅质和有机质外层形成，而硅藻的干重，其中有 4％～50％是硅质成分（Raymont, 1980）。不同种的硅藻生长时，所需要的硅质量会有差异（Graham and Wilcox, 2000）。硅藻的外壳有许多不同的形状（如附图三）。硅壳有上壳（epitheca）和下壳（hypotheca）之分。而硅壳上的装饰刻纹（ornamentation mark）是作为硅藻传统分类时的重要依据（Patrick andReimer, 1966; Round et al., 1990）。装饰纹可分为四种：1. 点纹（puncta）：硅壳上的小孔和小点称之，常是不规则的散布在硅壳上，或是会规律地排列成壳纹（striae）。2. 网孔（areolae or alveoli）：为壳面的小凹槽，会形成腔室般的构造。3. 小管（canaliculi）：为贯穿硅壳上的管状通路。4. 肋纹（costae）：为坚硬的肋状构造，可用来支撑硅壳，是由硅质高度堆积所形成。有纵沟亚目的壳上有壳缝（raphe），通常上下壳都会有壳缝的构造，但亦有只有一边有壳缝的硅藻（例如：曲壳藻科（Achnanthaceae）和卵形藻科（Cocconeiaceae），只有下壳有壳缝的构造）。壳缝两端以及中心有特厚的空白区域分别称为极节(polar nodule)与中间节(central nodule)（附图四）。无纵沟亚目的硅藻，硅壳上则没有壳缝的构造，但有些无纵沟亚目的硅藻（例如：脆杆藻（Fragilaria sp.）、缝舟藻（Rhaphoneis sp.））会有伪壳缝（pseudoraphe）的构造，是由两侧对称且排列紧密的壳纹或肋纹所形成的。壳上还有称为轴区（axial area）的部位，是沿着长轴方向，一道无纹路的窄区域，有时会形成伪壳缝。硅壳中央的区域称为中央区（central area），是由羽状目硅藻的壳缝所围成的区域。硅壳侧面平直的部分称为腰带（girdle），腰带可分为连结区（connecting zone）和中间带(intercalary band)。连结区是指上下壳相连接的部位，而中间带是指腰带扣除掉连结区的部分(Jin et al., 1985; Round et al., 1990)，中间带的宽度，会随着细胞的年龄及品种而有所不同。硅藻的营养细胞是不具有纤毛或是鞭毛的构造，是属于双套染色体细胞（diploid cell）。底栖性硅藻是利用分泌胶质的方式来进行移动，但无壳缝亚目的硅藻的移动能力较差。硅藻最常见的生殖方式，是无性的分裂生殖，硅藻会先复制细胞核，然后上下壳分离。上下壳分离的地方，会有硅质沈淀细胞的形成，会形成新细胞的下壳部分。圆心目硅藻的精子具有管状鞭毛的构造，可帮助游泳（Graham and Wilcox, 2000; Sze, 2000）。当硅藻进行无性生殖时，由于不断分裂并形成较小的下壳，会使得细胞尺寸越来越缩小。当硅藻的细胞大小指剩原本尺寸的二分之一（Sze, 2000）或三分之一（Graham and Wilcox, 2000）时，硅藻就会进行有性生殖。圆心目硅藻的有性生殖方式：2N 藻体进行减数分裂（亦即所谓的 gametic meiosis）来产生雄性配子（精子），并释放到水中，与已形成雌性配子（卵）的硅藻细胞结合，形成结合子，或称为增大孢子（auxospore）（附图五）。羽状目硅藻的有性生殖方式，则是两个配子母细胞共同分泌胶质，把两个配子母细胞包含在一起（亦即所谓的结合生殖），然后在胶质层中，配子以变形虫的方式互相交换，会形成一个或两个增大孢子（视硅藻品种而定）（附图六）。 硅藻含有的色素主要有岩藻黄素、叶绿素 a 和叶绿素 c。硅藻的光合作用产物主要为褐藻多糖（chrysolaminarin）和脂质。硅藻在缺氮的环境下，细胞中的油球会特别的明显（Raymont, 1980）。Faraloni et al.（2003）分析两种舟行藻的细胞外多糖（exopolysaccharide），发现其组成份包含有半乳糖醛酸（galacturonic acid）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid）、半乳糖（galactose）、阿拉伯糖（arabinose）、岩藻糖（fucose）、葡萄糖（glucose）、甘露糖（mannose）、鼠李糖（rhamnose）。一、硅藻门（bacillariophyta）微藻植物一门。硅藻普遍分布于淡水、淡水中和湿土上，为鱼类和无脊椎动物的食料。硅藻死后，遗留的细胞壁沉积成硅藻土，可作耐火、绝热、填充、磨光等材料，又可供过滤糖汁等用。约11000种。大多水生，几乎在所有的水体里都生长，只有极少数生活在陆地潮湿处。硅藻是水生动物的食料。浮游硅藻是淡水生态系统统中的主要的初级生产力。分类学家们一般认为硅藻来源于鞭毛藻，为一个特殊的分支。有现在生存的和化石的种类。根据壳面花纹的排列，将本门分为中心纲和羽纹纲。1、主要特征硅藻门植物细胞壁富含硅质，硅质壁上具有排列规则的花纹。壳体由上下半壳套合而成。色素体主要有叶绿素a、c1、c2以及β胡萝卜素，岩藻黄素、硅藻黄素等，同化产物为金藻昆布糖。藻体一般为单细胞，有时集成群体。细胞壁里有两片硅质壳,一大一小,像盒子一样套在一起。两片硅质壳，大的套在外面，叫上壳,较老；小的在里面,叫下壳,较年轻。2、形态结构2.1．细胞壁：无色、透明。外层为硅质，内层为果胶质。细胞壁含果胶和二氧化硅，质坚硬，常由套合的两瓣组成，并有呈辐射对称(辐射硅藻目)或左右对称(羽纹硅藻目)排列的花纹。(1) 壳面和带面：细胞壁的构造像一个盒子，套在外面的较大，为上壳；套在里面的较小，为下壳。硅藻上﹑下壳相互套合。上壳和下壳都不是整块的，皆由壳面（valve）和相连带（connecting band）两部分组成。壳面平或略呈凹凸状，壳面边缘略有倾斜的部分，叫壳套（valve mantle）：与壳套相连，和壳面垂直的部分，叫相连带，亦称带面。(2) 间生带：有些种类在壳套与相连带之间具有间生带，凡贯壳轴较长的种类都有间生带，其数目1条2条或多条，花纹形状主要有三类：鱼鳞状，如卡氏根管藻rhizosolenia castracanei；环状，如杆线藻rhabdonema；领状，如环形娄氏藻lauderia annulatus和中肋角毛藻chaetoceros costatus。(3) 隔片：具间生带的种类，有向细胞腔内伸展成片状的结构，称隔片(sepum)。如果隔片一端是游离的，称为假隔片，如斑条藻（grammatophora）；如果隔片从细胞的一端通到另一端，则称为全隔片或真隔片，如楔藻（climacosphenia）。间生带和隔片都具增强细胞壁的作用。(4) 突出物：硅藻细胞表面有向外伸展的多种多样的突出物，有突起、刺、毛、胶质线等。它们有增加浮力和相互连接的作用。突起：是细胞壁向外的头状突出物，如弯角藻ercampia。刺：一般细而不长，末端尖，其数目、长短不一，最粗大的刺如双尾藻ditylum，中等的刺如盒形藻biddulphia，较小的刺如圆筛藻cascinodi scus的缘刺。毛：为较细长的突出物，长度常为细胞直径的数倍，有的种类在粗毛里还有色素体，这是毛与刺的最大区别。此外还有膜状突起（如太阳漂流藻）和胶质线、胶质块等胶质突起（如海链藻）。（5）花纹：硅藻细胞壁上都具排列规则的花纹，主要有点纹：为普通显微镜下可分辨的细小孔点，单独或成条（点条纹）；线纹：这是由硅质壁上许多小孔点紧密或稀疏排列而成，在普通显微镜下观察时，无法分辨而是一条直线状；孔纹：为硅质壁上粗的孔腔，中心硅藻纲的孔纹基本为六角形，其结构很复杂；肋纹：为硅质壁上的管状通道，内由隔膜分成小室或壁上因硅质大量沉积而增厚。（6）三轴和三面：按硅藻细胞的方位分为纵轴、横轴和贯壳轴。由纵轴和横轴形成上、下壳面。由纵轴、贯壳轴形成长轴带面。由横轴、贯壳轴形成短轴带面。从壳面看，称壳面观；从带面（壳环面）看，称带面观(侧面观)。壳面和带面形状截然不同。通常中心硅微藻壳面呈辐射对称，多为圆形、椭圆形，也有三角形或多角形的；羽纹硅微藻，壳面一般细长，呈两侧对称，有舟形、卵形、弓形、Ｓ形、菱形、新月形和椭圆形等。带面（壳环面）一般为长方形、方形或楔形等。纵轴（apical axis）：为壳面中央的纵线，又称顶轴、长轴。横轴(transapical axis)：为壳面中央的横线，又称切顶轴、短轴。贯壳轴(pervalvar axis)：是上、下壳面中心点的相连线，又称壳环轴。2.2．色素体：硅藻的光合作用色素主要有叶绿素a、、c1 、c2以及β胡萝卜素，岩藻黄素、硅藻黄素等。色素体呈黄绿色或黄褐色，形状有粒状、片状、叶状、分枝状或星状等。2.3、同化产物：主要是油滴，显微镜下观察，油点常呈小球状，光亮透明。2.4、细胞核：硅藻的细胞核一个,常位于细胞中央，在液泡很大的细胞中，常被挤到一侧。用甲基蓝或尼罗蓝稀溶液染色，可见到细胞核。3、生殖方式硅藻常用一分为二的繁殖方法产生。分裂之后，在原来的壳里，各产生一个新的下壳。盒面和盒底分别名为上、下壳面。壳面弯伸部分名壳套。上下壳套向中间伸展部分，称相连带。上下相连带总称为壳环，这个面称壳环面。有些种类，如根管藻（rhizosolenia），在壳环面细胞壁上还有很多次级相连带，或称间板。细胞质和一般植物细胞相似。生殖方法有形成复大孢子、小孢子和休止孢子等。A、营养生殖  为硅藻最普通的一种生殖方式。分裂初期，细胞的原生质略增大，然后核分裂，色素体等原生质体也一分为二，母细胞的上、下壳分开，新形成的两个细胞各自再形成新的下壳，这样形成的两个新细胞中，一个与母细胞大小相等，一个则比母细胞小。这样连续分裂的结果，个体将越来越小。这在自然界和室内培养的硅藻可见到。b、复大孢子  硅藻细胞经多次分裂后，个体逐渐缩小，到一个限度，这种小细胞不再分裂，而产生一种孢子，以恢复原来的大小，这种孢子称为复大孢子。复大孢子的形成方式有无性和有性两种。（1）无性方式  是由营养细胞直接膨大而成，如中心纲的变异直链藻（melosira varians）。（2）有性方式  通过接合作用，借助运动或分泌胶质使个体接近，然后包围于共同胶质膜内，进行接合。3.小孢子  多见于中心硅藻的一种生殖方式，细胞核和原生质多次分裂，形成8、16、32、64、128个不等小孢子，每个小孢子具1- 4条鞭毛，长成后成群逸出，相互结合为合子，每个合子再萌发成新个体。4休眠孢子  是沿海种类在多变的环境中的一种适应方式。休眠孢子的产生常在细胞分裂后，原生质收缩到中央，然后产生厚壁，并在上、下壳分泌很多突起和各种棘刺。当环境有利时，休眠孢子以萌芽方式恢复原有形态和大小。4、分类概述根据壳的形状和花纹排列方式，硅藻门分成二个纲。中心硅藻纲centriae和羽纹硅藻纲pennatae。4.1、中心硅藻纲花纹辐射对称排列。细胞圆盘形、圆柱形或三角形、多角形等。细胞外面常有突起和刺毛。没有壳缝或假壳缝，不能运动。中心硅藻大多分布淡水中，淡水种类很少。本纲分成三个目。(1)、圆筛藻目coscinodiscales单细胞，或以壳面相连成链状或靠胶质丝连成链状，或埋于胶质内。细胞常为圆形，鼓形或圆柱形，透镜形等。横断面圆形。壳缘平滑，有的种类壳缘具小刺。常见属直链藻属melosira、圆筛藻属coscinodiscus、小环藻属cyclotella、海链藻属thalassiosira、指管藻属dactyliosolen、冠盖藻属stephanopyxis、辐杆藻属bacteriastrum、漂流藻属planktoniella、娄氏藻属lauderia（凸盘链藻属）、骨条藻属skeletonema、细柱藻属leptocylindrus、环毛藻属corethron。(2)、根管藻目rhizosoleniales细胞壳面大多椭圆形，少数圆形。贯壳轴伸长而呈管状，常有各种形状的间生带。壳面突起呈半球形、锥形、斜锥形等，末端常有小刺。常见属根管藻属rhizosolenia。（3）、盒形藻目biddulphiales单细胞或形成链状群体。细胞形状像一袋面粉或小盒子状，各角隅常有突起，有的还具小刺。壳面椭圆形或多角形。大部分在海洋中营浮游生活。有的种类能分泌胶质，营回着生活。淡水种类极少。常见属角毛藻属chaetoceros、半管藻属hemiaulus、四棘藻属atthetas、弯角藻属eucampia、盒形藻属biddulphia、双尾藻属ditylum、三角藻属triceratium。5、生态意义（1）、分布特点 硅藻广泛分布于淡水、淡水和半咸水中。硅藻是海洋浮游植物的主要组成者，是海洋初级生产力的一个重要指标。（2）、生态特点  鱼池清塘排水后，往往最先生殖的是菱形藻、小环藻等硅藻。这类既能浮游又能底栖（附生）的兼性浮游植物，大量发生可能与浅水、光照好及清塘后，水中硅酸盐含量丰富有关。硅藻在季节上，一年四季春、夏、秋、冬都能形成优势种群。（3）、饵料价值  硅藻死亡后的硅质外壳，大量沉积海底，形成的硅藻土，含有85.2%的氧化硅。在工业上用途广泛，可作为建筑、磨光等材料，过滤剂、吸附剂、造纸、橡胶、化妆品和涂料的填充剂，以及保温材料等。硅藻土  硅藻死亡后的硅质外壳，大量沉积海底，形成的硅藻土，含有85.2%的氧化硅。在工业上用途广泛，可作为建筑、磨光等材料，过滤剂、吸附剂、造纸、橡胶、化妆品和涂料的填充剂，以及保温材料等。化石硅藻对石油勘探有关的地层鉴定及古海洋地理环境的研究也有重要的参考价值。二、以固定化技术作为底栖性硅藻之保种：Chen（2003）以等鞭定鞭藻（Isochrysis galbana）之固定化藻珠作为文蛤（Meretrix lusoria）的饵料来源，获得良好的成果。利用褐藻酸钠（Sodium alginate）来包埋微细微藻，可以防止微藻被冲刷掉、被草食大鲵吃食，易于操作管理及长期保种（Chen, 2001）。褐藻胶藻珠的制备比其它的方法（如冷冻保存法）来得容易、便宜且随时可利用(Romo and Pérez-Martínez, 1997)。本研究亦尝试以初期饵料所需之硅藻，做成固定化硅藻藻珠，以作为纯种硅藻的保种，以提供将来应用池之饵料培养。▲ 图10-5，硅藻的季节变化和控制因子。实线表硅藻产量随季节而变化，其中有两个峰，一个在春季，另一个在秋季。虚线表示水中营养因子的变化。图   硅藻与饲料喂养生长曲线图10--6温度与硅藻生长关系图10--7微藻与营养盐关系三、硅藻纯种微藻的培养：本实验参考 Provasoli（1968）配方及 Guillard 的（1973）f/2 配方并修改之，配上过滤过的新鲜淡水（盐度 35‰），制成 PG medium（salinity= 35‰）。此 PG medium 另外添加 1 ml 内含 30 g/L 的硅酸钠（NaSiO）和 0.0013 g/L 亚硒酸（HSeO）的混合溶液，作为底栖性硅藻生长时合成硅壳所需要的硅质来源。因有些硅藻具有异营性，在弱光及黑暗的环境中会吸收溶解性有机颗粒(dissolved organic compound, DOC)，作为代替光合作用的能量来源（Graham and Wilcox, 2000)。因此本研究在每公升 PG medium 中另外添加自制的土壤萃取液（Soil extract）0.5 ml，作为有机质的来源。最后将配制好的培养液放入灭菌釜（Tomin TM-328）中在 1.1 atm，121℃下灭菌二十分钟后，冷却备用。 在容量 500 ml 的三角锥瓶中分别加入 100 ml 的池水及原水，分别添加 300 ml 的 PG35‰+Si+Se+Soil extract 培养液（简称为 PG modified medium）后，做预备培养。因为带回的原水中，可能会有某些硅藻的孢子尚未萌发，而这些孢子在显微镜下很难观察得到，预备培养可以让原水中出现更多数量和种类的微藻。 本研究是以划线法与稀释法进行微藻的纯化工作，方法如下：划线法需制作固体培养基（agar plate）作为微藻的附着基质。固体培养基制作如下：取 100 ml 的 PG modified medium 及2克 bacto-agar（DIFCO, U.S.A.）倒入容量 250 ml 的玻璃三角锥瓶内，用铝箔纸和橡皮筋将瓶口封上，放入不锈钢锅，以确保水气不会进入瓶中，最后置于灭菌釜中，在 121℃、1.1atm 灭菌 20 分钟。待灭菌结束后，趁尚未冷却固化前，倒入以迦玛射线（γ-ray）灭菌过的 150×14.5 mm培养皿（Alpha Plus, Taiwan）中，轻轻摇晃使其平铺均匀；待凝固后用石蜡膜（American National Can, U.S.A.）封好。在培养皿盖上写明制作日期、培养液种类，并用封口袋封好，置于 4℃冰箱保存备用。1. 取已经预备培养过的池水及原水，或是直接从繁殖场的浪板上刮取附着性硅藻的藻膜，以接种环或灭菌过的棉花棒沾取或刮取藻水来进行划线法，以纯化微藻。培养期间以倒立显微镜（PoTop, Taiwan）观察固体培养基上微藻生长的情形。 2. 当有单离的群落出现时，以接种环或毛细管将该群落接种到250 ml 的三角锥瓶（内含 150 ml PG modified medium）继续培养以增加微藻的密度（约需要七到十四天）。 稀释法：某些无法在固体培养基上生长的微藻，以此方法来加以纯化。图10—8浮游植物与硅藻生长曲线相似性图10--9硅藻生长与水温呈负相关1、先在光学显微镜下计数每一滴（0.05 ml）的预备培养液中有多少只藻。2. 用培养液将藻水稀释至每一滴水中仅有一只藻的状况。例如，每 1 ml 原水中有 1×10只藻，则取 1 ml 的原水加入 999 ml 的 PGmodified medium 稀释。3. 以 16×100 mm 的透明玻璃试管(Kimble, U.S.A.)，添加 5 mlPG modified medium，在管口塞上棉花塞，灭菌后备用。4. 每支试管中，分别滴入一滴或两滴稀释过的藻水，置于植物培养箱中，约七十二小时后观察微藻生长情形。5. 当管中出现单一或优势的藻种后，则直接转接到 250 ml 三角锥瓶中（内含 150 ml PG modified medium）继续培养。 以上进行纯化培养期间时，微藻皆放在植物培养箱（Firstek RI201,Taiwan）中，培养条件为：24 /2℃ 2℃（Light/Dark），12:12（Light/Dark），光度为 122 μmol photos ms·-1。硅藻图:10-10所示。（注:纯种化微藻以SEM黑白图显示）12第十二章娃娃鱼饵料生物的培养第一节娃娃鱼饵料生物的室内培养微藻培养方法简介微藻,特别是单细胞微藻的营养丰富,含有大鲵和人生长发育所必需的营养物质.自上世纪四十年代以来,各国学者都试图用微藻这一资源解决人类食物和动物饵料的缺乏问题.另一方面,微藻可直接或间接的作为鱼类及其它水生动物的饵料,因此,微藻培养对娃娃鱼繁殖具有更大意义.关于微藻培养,还有其它意义,从一些微藻提取药物;或研究微藻生理,以及用于太空食品等.在渔业利用方面,微藻培养主要是解决娃娃鱼饵料.今后,随着繁殖事业的发展,对一些新品种的繁殖以及解决某些品种幼鱼的饵料,必然涉及到微藻的培养.因此,有必要了解微藻培养的基础知识.先仅就微藻,主要是单细胞微藻的一般培养方法及有关理论加以简述.微藻的生长模式单细胞微藻在培养过程中,生长繁殖的速度,出现一定的起伏,这种生长模式可划分为六个时期一、拟球藻Nannochloropsis oculata金藻门 Chrysophycophyta真眼点藻纲 Eustigmatophyceae真眼点藻目 Eustigmatales单珠藻科 Monodopsidaceae1、生物特性拟球藻之细胞为小球体（图4d），直径2～4微米，无鞭毛，无眼点，外观与绿球藻极相似，故称之为拟球藻。唯细胞较小，藻色稍黄（培养老化时更明显），分裂时产生两个子细胞（绿球藻产生四个）。此藻在1986年始经日本筑波大学千原光雄等定名为 （annochloropsis oculata（Maruyama et al., 1986），在此之前在日本称之为海产绿球藻（marine Chlorella）。拟球藻属真眼点藻纲，含有叶绿素a及类胡萝卜素violaxanthin及vaucheriaxanthin ester，而绿球藻属绿藻纲则含有叶绿素a、b及类胡萝卜素lutein。拟球藻主要发生于温带水域。最近之研究（Gladu, et al., 1995）亦指出名为Chlorella minutissima UTEX 2341 Fott et Novakova之藻株，含有其它Chlorella 藻株没有的sterols，如cholesterol、isofucosterol、24～methylenecholesterol及fucosterol及，并含有20：5n3、chlorophyll a及 violaxanthin，不含 chlorophylls b 或 c；应亦属真眼点藻纲之 Nannochloropsis sp。其在生长停滞期的细胞有相当比例具有细胞外构造，离心会移去或瓦解该构造。 Nannochloropsis 属细胞内之色素成份chlorophyll a：b：c：p（carotenoid）之比值为1：0.00～0.03：0.01～0.03：0.04～0.54，但Chlorella属则为1：0.34：0.02：0.35。因此某些分类上名为Chlorella属者，其真正类别待验证。真眼点藻纲亦包含原属绿藻纲之Nannochloris oculata及原属黄藻纲（Xanthohyceae）之Monallantus salina 。绿藻纲含Chlorophylla＆b及类胡萝卜素lutein，黄藻纲含chlorophylla＆c及类胡萝卜素didinoxanthin＆diatoxanthin，真眼点藻纲含Chlorophyll a及类胡萝卜素violaxanthin＆vaucheriaxanthin ester。其中N. oculata具有urease（尿素分解酵素），细胞二分裂，不产生动孢子。 Ellipsoidon与Monallantus为同属异名（Bourrelly 1968，cited in Antia et al.,1975），故E. acuminatum 亦为真眼点藻纲之一成员（Hibberd and Leedale，1972，cited in Antia et al.,1975）。2.培养方法（1）温度、盐度、光照度及pH值：拟球藻在10～35℃温度范围内均能增殖，而以25～31℃间之增殖率最高，在37℃之水温环境中2～4小时仍能活存，且于降温后仍能增殖。对盐度之适应范围甚广，在5～77ppt范围内均能增殖，而以20～35ppt盐度之增殖最好。喜欢强光照，增殖率随照度增加而增加，至12,000 lux时增殖率达最高，且维持不变至30,000 lux仍可维持最高增殖率。培养液最初的pH值与增殖率间之关系呈抛物线，以pH7.5～8.8之增殖最好。日本屋岛试验场于1963年在1吨水槽中施肥，培养采自屋岛湾之硅藻，起初硅藻滋生繁茂，不久即渐减，且水色由褐转绿，终于变成以海产绿球藻为优势种。于是接入桡足类饲养，但不久桡足类即渐死亡，仅剩微藻仍继续增殖。而后虽弃之不管，但随着藻色渐淡，却伴生许多白色小点的壶形轮虫。得此启示，研究人员乃开始以拟球藻培养轮虫，并以轮虫投喂鱼苗，展开海产鱼介类种苗生产的新页。拟球藻含有丰富的二十碳五烯酸（EPA），故颇适于壶形轮虫的培养与营养强化，以及种苗培育池之水色维持。（2）肥料：拟球藻最初于日本屋岛试验场培养时，所用之肥料为硫酸铵50g/吨、过磷酸钙15g/吨、帝国化学制造之Clewat-32（微量金属混合物）5g/吨。目前，日本各大鲵试验场、栽培渔业中心之使用量为：硫酸铵50～100公克/吨、尿素10～60公克/吨、过磷酸钙15～30公克/吨、Clewat-32 0～5公克/吨。依据笔者试验结果，使用单一氮肥时尿素效果最好，不过混合等浓度硫酸铵及尿素之肥效比单一氮肥更好，因此，目前使用硫酸铵66公克/吨、尿素30公克/吨、过磷酸钙30公克/吨。一般于培养之始以全部水量来计算基肥使用量，且于再添新水时再施肥，施肥量以所加水量计算。3、培养流程：(1）、清洗水槽，使用有效氯10％左右之工业用漂白水消毒水槽、打气管及打气石。漂白水使用量为10～20 ppm有效氯，亦即1吨水加100～200 ml工业漂白水。(2）、培养槽注入淡水，接着加入10 ppm有效氯之漂白水，静置隔夜后，再加入10 ppm（10公克/吨）硫代硫酸钠（海波）中和残余氯，然后接种良好藻种，藻种与新注入淡水的比例为1/1～1/5，视种源质量、淡水水质及气候而定。另外，可使用淡水及自来水（藉水中余氯来消毒）调成盐度15～20 ppt之培养用水。(3）、施肥打气培养至水色不再变浓时（约4～7天），收获1/3水量之藻水，供作轮虫培养或其它水槽接种用种源，而后原水槽再加入新淡水，并添加肥料，如此重复进行至藻细胞增殖不良时全部收获；或采回分式培养，当水色不再变浓时，一次全部收获。(4）、如需再培养则从流程(1）开始。4、问题点与改善方法：(1）、轮虫感染：注意藻池与轮虫池之分开，使用器具需加以隔离，工作人员须谨慎操作，感染之藻池必须以漂白水浸泡消毒后再使用。(2）、原生动物感染特别在高水温期易发生，因此，各项设备及用水需使用漂白水加以消毒，以减缓感染。最好的预防方法是利用藻种优势抑制原生动物的感染，亦即收获量或加新水量需少于总水量的1/2，而每间隔3～5天收获一次。(3）、其它微藻感染：选择优良种源，并采藻种优势培养，可有效抑制其它微藻感染。(4）、藻色变化之控制：注意水质及天气变化，适时注水降温、降pH值，移殖或收获。(5）、搅拌及光照之控制：由于细胞不会游动，若打气不足，培养较长时，底部会有沉淀层，因此需每日大搅拌一次将池底扬起。拟球藻喜强光，藻浓度高时，由于细胞相互遮蔽，会降低光照强度，故需降低水位以增加照度，有覆盖时，水深以30～40cm为宜，露天时不超过100cm，冬天水位宜低，夏天可加深。(6）、日本研究人员冈内正典（国立南西海区大鲵研究所）私人通信（1997）指出，在下雨季节，由于某些鞭毛虫及纤毛虫的增加，导致户外大量培养槽中藻浓度骤减。尝试许多种处理方法，迄今仍未找到一确定有效的方法。当然地，可用氯作杀菌与杀虫剂来处理接种前之培养用水，但其作用不清楚。通常，当培养液中之原生动物增加时，丢弃所有之培养，重新再来。所以应保存小量培养，不受污染，然后接种于大量培养中。一般在仔鱼饲育季节前，维持10支以上15mL的无菌培养。然后接种于500mL三角瓶，再接于10 L玻离瓶。这些培养用水均用高压高温灭菌釜处理。仔鱼饲育季节时，培养10至20个10 公升玻璃瓶。 10 公升玻离瓶用来接种户外培养，在短期内，完全用来培养轮虫；若取大量培养之部份藻水作种源，再接种做作大量培养，结果一般不好。最近，在日本有许多繁殖场，用滤心及淡水灭菌设备（UV-Ozone 或 UV），结果还好，但还不是最好。因此，被迫使用商品化的淡水绿藻取代拟球藻来培养轮虫。