科研│NAT CELL BIOL：中国医学科学院和剑桥大学|单细胞转录组分析追踪移植后造血干细胞的分化
编译：刘娟，编辑：景行、江舜尧。
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由于技术的限制，移植后的造血干细胞(HSCs)在预条件性宿主体内定位后的行为尚未被研究。本文利用单细胞RNA测序，首先获得28种造血细胞的转录组分类,然后将其与功能测定结合使用，以追踪移植后第1周内免疫表型纯化HSCs的动态变化。根据转录分类，大多数在骨髓和脾脏中归巢的HSCs成为多能祖细胞，偶尔有一些HSC产生巨核细胞-红系或髓系前体。体内外平行功能实验支持第1周没有实质性HSC扩张的稳健分化模式。因此，本研究阐明早期移植HSCs在骨髓清除者受体内的动力学和命运选择，对HSCs和其他干细胞的临床应用具有一定的指导意义。
论文ID
原名：Global Gene Expression Analysis Identifies Age-Related Differences in Knee Joint Transcriptome during the Development of Post-Traumatic Osteoarthritis in Mice
译名：单细胞转录组分析追踪移植造血干细胞的分化
期刊：Nature Cell Biology
IF：20.042
发表时间：2020年6月
通讯作者：程涛；Berthold Göttgens
通讯作者单位：中国医学科学院，剑桥大学
DOI号：10.1038/s41556-020-0512-1
实验设计
结果
1 小鼠造血细胞的单细胞转录组
scRNA-seq分析成年C57BL/6小鼠骨髓(BM)或脾脏(SP)28个造血细胞群，建立 血液系统单细胞转录组文库(图1a)。利用成熟的细胞表面标记物荧光激活细胞分选法分离单细胞，共有1270个单细胞通过质量控制(≥1000个基因表达)，被用于绘制血液系统图谱。单细胞造血干／祖细胞数据的扩散映射显示清晰的谱系分支，与之前发表的数据集高度吻合，证明本研究测序数据质量的可靠性。
然后，系统比较免疫表型定义的细胞转录组。主成分分析(PCA)和非监督层次聚类显示免疫表型HSCs具有显著的转录异质性(iHSCs；图1b)，5种类型的iHSCs被分为三个不同转录特征群：tHSC1、tHSC2和tHSC3(图1c)。Egr1和Nr4a1、Sh3gl1和S100a9、Cd79a和Blnk分别在tHSC1、tHSC2和tHSC3中特异性高表达(图1d)。tHSC1包含不同比例的所有iHSCs，而tHSC2包含4个群体的iHSCs，除了基因片段III，它占tHSC3的85%以上(图1e)。相比之下，除基因片段III外，每个iHSC群中有50-71%细胞为tHSC1细胞，29-45%细胞为tHSC2细胞。基因片段III由70%的tHSC1和30%的tHSC3组成，不含tHSC2(图1f)。
图1.iHSCs的单细胞转录组。a，对28个细胞群(共1270个细胞)进行scRNA-seq,代表造血细胞经典层次。CLP，共同淋巴祖细胞；CMP，普通骨髓祖细胞；EryA和EryB，红细胞A和B；GMP,粒细胞－巨噬细胞祖细胞；MEP，巨核细胞－红细胞祖细胞；NK,自然杀伤细胞。b，5个iHSCs群体中不同表达基因的热图和非监督层次聚类。右侧列出每个簇中特异性表达基因的代表性GO富集。根据转录组谱将三簇HSCs (tHSC1、tHSC2和tHC3)分组。ER,内质网;HSCLT,长期HSC。c, UMAP显示5个iHSC群中的3个异质性群:tHSC1(n=189)，tHSC2 (n=93)和tHSC3(n=23)d,tHSC1(n=189)、tHSC2 (n=93)和tHSC3(n=23)中特异性表达基因归一化表达值(log2(TPM/10+1))分布的箱形图。e, 5个iHSC群体(tHSC1:n=189,tHSC2:n=93,tHSC3:n=23)中每个tHSC组成的直方图。f，骨髓间充质干细胞组成的饼图(HSCLT:n=22；基因I:n=102；基因III:n=66；ESLAM (EPCR+CD150+CD48-CD45+):n= 58；ESLAMSK:n=57)。
9种免疫表型多能性祖细胞(iMPPs)被分为5个不同转录特征群：tMPP1、tMPP2、tMPP3、tMPP4和tMPP5(图2a)。iMPPs和 tMPPs的转录组成均表现出较大转录异质性(图2b,c)。基因表达谱将祖细胞,红细胞,巨核细胞,粒细胞,单核－巨噬细胞和淋巴细胞聚为一类,称为tCP1-3(祖细胞),tME1-3 (巨核细胞－红细胞)，tGM1-3 (粒细胞－单核细胞－巨噬细胞)和tLym1-4 (淋巴细胞－淋巴细胞)，然后根据免疫表型细胞计算这些群体的组成。转录组分析将28个造血群体分为21个群，每个簇都特异性表达与功能相关特征的独特生物学过程富集的基因。
转录组分析显示，大多数tHSCs和tLyms如预期那样处于静止状态，但tMPPs和tCPs在细胞周期状态方面具有显著的变化。基因集富集分析(GSEA)显示，与tHSC2或tHSC3相比，tHSC1表现出最强HSC标志基因的转录活性，与它们的静态标志一致。此外，基于巨核细胞、红系、髓系和淋巴系相关基因的共表达，推测多系分化潜能在tHSC1中比tHSC2中更丰富，而tHSC3似乎更倾向于向红系和淋巴系分化。tMPP1表现出较高的HSC标志基因，tMPP2活跃表达前巨核细胞-红细胞和巨核细胞祖特征基因。相比之下，tMPP3表达前粒细胞单核细胞特征基因，而tMPP5表达共同的淋巴祖细胞。这些结果符合移植结果验证的基于iMPPs的tMPP组成(图2c)。与已发表的数据一致，Procr,Esam和Necdin等基因也在tHSCs和/或tMPP中选择性表达。
值得注意的是，tHSC3在轨迹图上与tHSC1和tHSC2明显不同(图2d)，而且tHSC3在很大程度上与基因III重叠，之前研究和我们的数据分析显示，基因III具有长期的淋巴细胞偏倚重建潜能。因此，tHSC3可能在功能上更多地与短期HSC或MPPs相关。tMPP1细胞在细胞周期中比tHSCs更活跃，分化轨迹分析表明，它们的分化潜能接近(图2d)。总的来说，该轨迹图在上半部分与造血干细胞到MPPs的连续过程一致，在下半部分有明确的髓系和淋巴系分支。因此，这21个转录组定义的细胞簇是评估应激条件下细胞特性的有力参考工具，特别是当细胞表面标记不稳定或细胞产量低导致移植后不久无法对移植的造血干细胞进行详细表型分析时。
图2.iMPPs的单细胞转录组及造血细胞的轨迹分析。a, 9个iMPP群体中不同表达基因的热图和无监督层次聚类。右侧列出每个簇中特异性表达基因的代表性GO富集。根据转录组谱将tMPPs分为5类(tMPP1-5)。HSCST表示短期HSC。b,9个iMPP群体中每个tMPP组成的直方图(tMPP1：n= 100；tMPP2:n=145；tMPP3:n=95；tMPP4:n=93；tMPP5:n=75)。c,tMPPs显示各iMPP组成的直方图(HSCST:n=41；LMPP(CD34+CD135+LSK):n=31；MPP1-4:n=72、72、76、78；基因II: n=49；HPC2: n=44；HPC3:n=45)。d，Monocle算法对血液系统(共21个细胞簇)的轨迹分析。
2 移植后HSC向mosaic祖细胞的分化
基于上述转录组所有造血细胞类型的特征，研究者试图追踪受辐射个体移植后HSC的性质。从绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠(B6-Ly5.2, GFP+)中纯化的HSC (CD201+150+48−45+Sca-1+c-Kit+ (ESLAMSK))共1000-4000个，与3×105个竞争细胞(B6-Ly5.2, GFP-)一起移植到受辐射个体(B6-Ly5.2)中。在移植后第1、3、5和7天收集供者GFP+细胞(57个移植受者的1031个细胞)，开展scRNA-seq(图3a)。供体GFP+细胞采集率极低(第1、3、5和7天分别为0.005±0.007%、0.006±0.004%、0.012±0.009%和0.22±0.292%)；具有代表性的流式细胞图见图3b。与移植后ESLAMSK细胞相比，供体细胞整体基因表达早在移植后第1天就发生显著变化。通过对转录因子(TF)调控因子的分析，进一步阐明转录因子网络的动态转录活性。编码自我更新相关TFs基因（如Egr1、Egr3、Gata2和Hmga2）逐渐下调。髓系细胞(Cebpa、Cebpab、Cebpad和Cebpae)和红细胞－巨核细胞(Irf2)相关的TFs基因在移植后第1天表达上调并共表达。这些结果表明，移植的造血干细胞和/或其后代表现出弱自我更新特征，并在移植后的非常早期阶段采用一种转录程序将其限制在一个或多个谱系。
根据稳态下细胞类型特异性的特征基因将移植细胞分为21个细胞簇,这些细胞身份相关基因在移植后的单个细胞中持续表达。动态平衡状态下所有造血细胞的t分布随机邻域嵌入图(图3c)显示,移植后1周内tHSCs、tMPPs、tMEs和tGMs再生，而tCPs和tLyms很少(图3d)。与注射tHSCs相比，移植后每天的细胞组成清楚表明移植的HSCs定向成为tMPPs，甚至在第1天产生少量tMEs和tGMs(图3e,f)。从移植后1周内的细胞动力学来看，tHSCs(主要是tHSC1和tHSC2)的比例逐渐下降，而tMPPs是主要的人群，甚至在第1天和第7天出现一些tMEs和tGMs(图3f,g)。每个代表性受体的细胞重组表明，tMPPs在移植后不久即成为主要的细胞类型。第1天和第7天出现部分谱系性细胞，特别是tMEs(17个受者中有6个)和tGMs(8个受者中有2个)(图3h)。为排除第1天采集的细胞存在取样偏倚可能性，另收集137个供体骨髓和脾脏细胞，转录组的细胞分类结果与图2g所示一致，符合移植的造血干细胞在1周内立即分化为祖细胞和谱系细胞(tMEs和tGMs)的模型。
移植后HSC第1天的转录组快速变化促使研究者思考转录组改变是否依赖于细胞分裂。为此，将CellTrace Violet染色的供体HSC移植到受体小鼠体内，移植后收集发现，大多数供体细胞在第1天保持不分裂，但从第3天到第7天逐渐分裂(图4a-c)，表明造血干细胞MPP转录组谱不依赖于细胞分裂。
图3.造血干细胞移植后植入细胞的组成。a，供体GFP+细胞移植后scRNA-seq实验设计。b，供体GFP+细胞在指定时间点(第1、3、5和7天)的代表性流式细胞术图。第1、3、5和7天分别有6、6、2和2个生物重复。c，稳态下所有单细胞的t-SNE图。共21个细胞簇，包括tHSC1-3、tMPP1-5、tCP1-3、tME1-3、tGM1-3和tym1-4。d，供体单细胞移植后第1天至第7天的t-SNE图。e，移植细胞(输入)和供体细胞在t-SNE图上显示输出时间点的分布和细胞动力学。f，移植后第1、3、5、7天各细胞类型的动态频率。g，输出细胞中不同亚组在指定时间点的动态频率。h，每个代表性受体小鼠在不同时间点的输出细胞类型组成。tLineages包括tMEs,tGMs和tLyms。
图4.供体细胞移植后的细胞分裂情况。a.用细胞示踪紫染色BM c-Kit+培养细胞2天，用细胞示踪紫荧光强度流式细胞仪测定细胞分裂。b.骨髓移植后第1、3、5和7天染色的供体细胞代表性流式细胞术图。c.骨髓移植和SP中供体细胞分裂数的直方图。数值代表平均值±s.e.m.
3 移植后HSCs中HSC和MPP亚型的动态变化
进一步分析tHSC1和tHSC2移植后的转录组变化(简称Tx tHSC1/2)。与输入HSC相比，输出tHSC1和tHSC2表现出造血干细胞信号的下调(图5a)。tHSC1的增殖特征减弱，而tHSC2的增殖特征增强，这与循环细胞中输出tHSC2相对于输入tHSC2增加的比例一致(图5a,b)。至于假定的分化潜能，tHSC1在巨核细胞系、红系和髓系分化上富集降低。相反，tHSC2被诱导向红系和髓系分化(图5c)。与稳态下的同类相比，Tx tHSC1/2在淋巴、凋亡或自噬信号富集方面没有差异(图5c)。基于Tx tHSC1/2细胞增殖和分化偏向性的改变，研究者认为tHSC2细胞为满足分化功能细胞需要而呈现出激活反应(启动状态)，而tHSC1细胞在再生压力下维持HSC池，处于静止状态。这一模式与之前功能性研究一致，表明功能性HSC的两种不同细胞状态。
接下来研究tMPPs，它是移植后造血干细胞快速进化而来的主要成分。tMPP1在第3天占供体细胞的30%以上，在第7天持续下降至5%以下。tMPP2在第5天占40%以上，在第7天下降到20%。tMPP3的频率最初小于5%，在第7天急剧上升到30%。tMPP4维持在低频率，而tMPP5在移植后第5天逐渐升高到20%(图5d)。tMPP2和tMPP3的频率增加伴随着S/G2/M细胞周期信号的百分比升高。
GSEA利用特定基因进一步研究tMPPs的分化谱，并与相应的对照在稳态条件下进行比较(图5e)。tMPP1表现出更高的增殖特征，有利于向红系和髓系分化，并抑制巨核细胞。tMPP2对髓系基因呈正富集，对巨核基因呈负富集。tMPP3和tMPP4分别表现为红系和巨核基因富集。与巨核细胞、红系细胞和髓系细胞相关的基因集在tMPP5中富集，而淋巴潜能被抑制。具体来说，红细胞(Phb2和Nfia)、巨核细胞(Pf4和Vwf)、髓系细胞(Spi1和Cebpd)和淋巴细胞(Flt3和Satb1)的代表性TF或标记基因在不同的tMPPs上表达可能触发移植后谱系分化。与稳态下相比，移植后tMPPs(简称Tx tMPPs)表现出应激反应相关基因Ifitm3、S100a6和Serpina3g的上调，B细胞分化基因Ramp1、Cd52和Pnp的下调(图5f,g)。氧化磷酸化、剪接体和RNA转运途径与1周内tMPPs的动态变化有关。表面蛋白CD201、CD150和CD48的表达变化支持移植后1周内的细胞类型转变(图5h)。总的来说，这些结果表明，Tx tMPPs中髓系和红系分化稳定，而淋巴细胞分化受到抑制。
图5.移植HSC的时间命运变化及分化趋势。a，与HSC特征相关的基因GSEA(上)和增殖(下)比较Tx的tHSC1/2和ESLAMSK的tHSC1/2。b，稳态下，Tx tHSC1/2在指定时间点的细胞周期所占百分比(Tx tHSC1/2的n分别为16和15,tHSC1/2的n分别为189和93)。c，与ESLAMSK tHSC1/2相比，Tx tHSC1/2与ESLAMSK tHSC1/2分化(巨核、红系、髓系和淋巴系)特征的GSEA (a和c, Tx tHSC1/2分别为16和15,ESLAMSK tHSC1/2分别为34和22)。d,总共tMPP1-5供体细胞的百分比表示时间点(在1、3、5和7天，tMPP1的n=32,53,68和16, tMPP2的n=28,53,170和97, tMPP3的n=1,0,6和107,tMPP4的n=6,4,20和26, tMPP5的n=10,17,76和63)。e，移植后tMPP1-5(缩写为Tx tMPP1-5, n分别为169、348、114、56和166)与稳态(n分别为100、145、95、93和75)的提示信号GSEA。f，火山图显示差异表达基因(dots)比较在稳态下(n=508)和移植后(n=853)的tMPPs。红点、绿点分别代表上调基因和下调基因。g, GO的上调(红色)和下调(蓝色)基因比较Tx tMPPs和tMPPs。h，流式细胞仪显示供体细胞在移植后第1天和第7天的表面标志物。
4 tHSC丰富度逐渐减少的功能验证
使用单细胞集落形成试验和二次移植来检测供体细胞移植后的植入和分化潜能。与新鲜HSC相比，供体细胞的集落形成率降低(第1、3、5和7天，供体细胞的集落形成率分别为12.93±5.85%、23.95±6.66%、10.05±3.95%和21.2±4%，而新鲜HSC的集落形成率为62.34±8.34%)(图6a)。细胞从第1天和第3天生成50-80%非常小(直径<0.3毫米)和小(直径在0.3-1毫米)克隆,而细胞从第5天和第7天生成50-60%中型(直径1-2毫米)和大型(>2毫米直径)克隆(图6b)。此外，第1天和第3天供体细胞的多谱系菌落(中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞和巨核细胞)与新鲜HSC相当，而第5天和第7天供体细胞的多谱系潜能略有下降(图6c)。重要的是，第1天从受体骨髓和脾脏中回收的GFP+细胞在二次移植中表现出持续的多谱系植活度。同时，在第3、5、7天恢复的细胞中，即使收集到更多的细胞，重构效率和植入水平也逐渐下降(图6d)。这些数据表明，移植后HSC匹配的概率立即下降，与scRNA-seq分析的结果一致。尽管大多数注射的造血干细胞在其转录组谱基础上类似MPPs，第1天(未分裂)收集的细胞仍然具有HSC的长期移植能力。
进一步明确首次移植后收集的供体细胞长期持续重建的细胞来源。将聚乙乙烯醇(PVA)为基础的造血干细胞体外培养系统应用于从第1天到第3天收集的细胞培养48小时，然后进行scRNA-seq。移植后的细胞大多在培养后分化，这些细胞中的少数与新鲜造血干细胞保持相同的转录组状态(图6e)。有限稀释法 (LDA)显示,HSC的重组效率第1天和第3天远远高于在第5天和第7天。因此，所有这些体内外分析与模型一致,即移植后早期的长期重建潜能主要来自保留的小部分tHSCs，这些干细胞既保持其分子状态，又保持其功能状态。
图6.供体细胞移植后功能评估。a，移植后收集供体细胞与新鲜ESLAMSK细胞集落形成率。新鲜、第1天、第3天、第5天、第7天集落形成率分别为62.34±8.34(n=4)、12.93±5.86(n=3)、23.95±6.66(n=3)、11.26±6.38(n=2)、21.22±4.00(n=2)。新鲜ESLAMSK细胞和供体细胞的菌落大小。根据菌落直径(d)将菌落大小分为4种类型(新鲜、第1天、第3天、第5天、第7天的n分别为82、21、56、16和103)。c，细胞离心和Giemsa染色后形态学鉴定的菌落类型(新鲜、第1天、第3天、第5天、第7天分别为n=66、13、48、13、45)。E,成红血球细胞;m,巨噬细胞;M,巨核细胞;n,中性粒细胞。d，首次移植后指定时间点从骨髓(上)和脾脏(下)收集供者细胞，在受体PB中进行移植。移植细胞的数目列在下面，分别于移植后第1、3、4个月监测细胞的再生情况 (第1、3、5、7天，观察骨髓收集细胞n=2,4,4,2，观察脾脏收集的细胞n=1,4,3,3)。e，柱状图显示有或没有PVA培养的细胞基于转录组分类组成。根据转录组图谱对细胞亚群进行分类，新分离的ESLAMSK细胞(56个细胞)和培养后的ESLAMSK细胞(91个细胞),第1天收集供体细胞(50个细胞)和第1天培养后(112细胞), 第3天收集供体细胞 (77个细胞) 和第3天培养后 (133细胞)细胞测序。
5 移植后HSC的红系和髓系前体
令人惊讶的发现是移植后造血干细胞tMEs和tGMs的早期分化(图3g,h)。在供体总细胞中，tMEs和tGMs的频率在第1天达到约10%，然后在第3天和第5天急剧下降到0%，但在第7天再次上升到10%(图7a)。流式细胞术分析显示，第1天和第7天的Ter119+和Mac-1+Gr-1+细胞分别占20%和10%(图7b)。这些数据表明，移植后HSC可能最早在第1天通过“旁路”途径直接程序化进入红系和髓系，这与最近的一项研究一致，即HSC分化可以发生在第一次细胞分裂之前。单细胞反转录定量PCR (qRT-PCR)显示，供体Ter119+细胞在第1天表现出更高的干细胞相关基因(Kit、Slamf1、Fgd5和Gata2)、巨核细胞(Pf4和Selp)和红系基因(Lmo2和Tal1)的表达。供体Mac-1+Gr-1+细胞表现出类似髓系基因表达(Csf1r、Csf2rb和Csf3r)(图7c)。此外，免疫应答相关基因第1天在tMEs中高表达，第7天靶向膜蛋白相关基因的表达水平升高(图7d)。这些数据表明，tMEs第1天的不成熟状态可能是由微环境中应激反应触发。与外周血(PB)血清中稳态对照相比，红细胞生成素(EPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)这两种主要的生长因子分别参与红细胞分化和髓系分化，在移植后红细胞生成素(EPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的蛋白水平显著升高(图7e,f)。升高的细胞因子水平可促进有限的谱系分化。因此，移植后tMPP2、tMPP3、tCP1、tME1和tGM1中Ifitm1的表达显著增加，表明红系和髓系分化程序激活。总的来说，这些数据证实移植后造血干细胞和/或骨髓基质细胞存在早期的红细胞和骨髓细胞偏倚分化，但这些“分化”细胞仍然保持某些未成熟的特征，它们的生理作用和意义，尤其是在压力或损伤条件下，值得进一步研究。
图7.HSC移植早期细胞前体的出现。a，在指定时间点，tMEs和tGMs在供者总细胞中的百分比(移植后第1,3,5和7天，tGMs中n=14,1,5和56，tMEs中n=19,1,1和31)。b，移植后第1天和第7天供体细胞(GFP+细胞)中Ter119和Mac-1/Gr-1表达的流式细胞术图。Don代表供者；Rec代表受者。c，第1天通过单细胞qRT-PCR比较供体Ter119+细胞与受体Ter119+细胞(左)、供体Mac-1+/Gr-1+细胞与受体Mac-1+/Gr-1+细胞(右)特异性表达基因的热图。d，移植后第1天和第7天差异表达基因的时间热图，以及第1天(绿色)和第7天(红色)富集上调基因的GO terms。e，指定时间点PB血清中EPO浓度。对照(Ctrl)、第1天、第3天、第5天和第7天EPO水平分别为0.03±0.04(n=3)、0.13±0.01(n=3)、0.28±0.07(n=7)、0.42±0.22(n=6)和1.52±0.33 (n=4)。f，指定时间点PB血清中G-CSF浓度。对照组、第1天、第3天、第5天和第7天G-CSF水平分别为0.38±0.11(n=3)、1.73±0.54(n=7)、18.33±6.30(n=7)、34.21±9.90(n=6)和45.45±17.45(n=5)。
总结
本文scRNA-seq数据为血液系统不同分化阶段和谱系的细胞特性分类提供参考。成人骨髓造血谱系分化的分支早在tHSC和tMPP阶段就出现。大多数移植HSC都定向成为tMPPs，倾向于分化为红-巨核系和骨髓系，与稳态下的造血系统形成鲜明对比，这可能是主要的造血动力来源。
由于scRNA-seq的破坏性，本文开展的时间过程测量依赖于顺序快照测量。多种调控机制可能参与HSCs的动态过程，但功能研究符合scRNA-seq测量推断的移植HSC有限自我更新和快速分化的假设。在条件性受体中注射HSCs，部分HSC可能出现凋亡增加或归巢效率低下。本文重点讨论能成功存活并归巢的移植细胞特征和功能。至于供体HSC的行为，转录分析和功能评估都表明，移植细胞的增殖伴随着造血干细胞的相对比例逐渐下降。至关重要的是，增殖、分化和干细胞之间存在平衡,在种群水平上保留HSC功能(图3g和6c)。重建可能来自第1天和第3天罕见的保留HSCs,但我们不能排除部分分化细胞可能在重建过程（第1周以后）后期恢复到HSC状态,这值得进一步研究。
本研究基于功能、免疫表型的经典定义,利用scRNA-seq对HSC或其他再生细胞群进行单细胞分辨率下转录组分类，全面分析和跟踪干细胞如何更好的适应和修补受损或病变组织,对进一步探索和改进干细胞治疗具有重要意义。
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